包含地球上一些最小生命形式的古老微生物群也擁有迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的CRISPR基因編輯機制。被稱為Cas14 的peewee 蛋白質(zhì)機制僅與Cas9蛋白質(zhì)的三分之一相關(guān)，Cas9蛋白質(zhì)是革命性基因編輯工具CRISPR-Cas9的商業(yè)終端。雖然Cas9是從細(xì)菌中分離出來的，但Cas14是在一群古細(xì)菌 - 一種細(xì)菌的原始親屬 - 的基因組中發(fā)現(xiàn)的，它包含一些已知的最小細(xì)胞和最小的基因組。

Cas9和其他Cas蛋白是微生物進化的防御系統(tǒng)的一部分，以保護自己免受病毒侵害。所有這些都是靶向酶，它們非常有選擇性地尋找和結(jié)合微生物中的特定DNA或RNA序列，這些酶與早期病毒感染后存儲在其CRISPR記憶庫中的序列相匹配 - 然后切割DNA或RNA以禁用新的入侵者。

與Cas9一樣，Cas14具有生物技術(shù)工具的潛力。由于其體積小，Cas14可用于編輯小細(xì)胞或某些病毒中的基因。但憑借其單鏈DNA切割活性，它更有可能改善目前正在開發(fā)的傳染病，基因突變和癌癥的快速CRISPR診斷系統(tǒng)。

“對于分子診斷學(xué)，你希望能夠靶向雙鏈DNA，單鏈DNA和RNA，”加州大學(xué)伯克利分校研究生Lucas Harrington說道，他是報道這一發(fā)現(xiàn)的論文的第一作者。“Cas12非常擅長雙鏈DNA識別，Cas13非常擅長單鏈RNA識別，現(xiàn)在Cas14完成了這一系列：它非常擅長單鏈DNA識別。”

Cas14類似于Cas12和Cas13，因為在與其靶DNA序列結(jié)合后，它開始不加選擇地切割細(xì)胞內(nèi)的所有單鏈DNA。相反，Cas9僅結(jié)合并切割靶DNA。

肆意切割DNA是治療中可能的缺點，但在診斷方面具有很大的優(yōu)勢。Cas14蛋白可以與附著在一條單鏈DNA上的熒光標(biāo)記物配對。當(dāng)Cas14與其靶DNA序列(一種癌基因或感染性細(xì)菌中的基因)結(jié)合并開始切割DNA時，它也會切割與標(biāo)記物連接的DNA，從而產(chǎn)生熒光信號。

“Cas14以比Cas12更具體的方式靶向單鏈DNA，”Harrington的同事Janice Chen補充道，她最近獲得了博士學(xué)位。來自加州大學(xué)伯克利分校。“這是一個非常意外的發(fā)現(xiàn)。因為它太小了，我們幾乎認(rèn)為它不起作用，但實際上它是超級特定的，這使它成為診斷工具箱的一個非常強大的補充。”

Harrington，Chen及其同事，包括CRISPR-Cas9發(fā)明人Jennifer Doudna，加州大學(xué)伯克利分校，細(xì)胞生物學(xué)和化學(xué)教授，已經(jīng)改編Cas14，使用名為DETECTR的診斷系統(tǒng)，現(xiàn)在使用Cas12和Cas13快速檢測傳染性生物和基因突變的存在。Harrington，Doudna和Chen是一家名為Mammoth Biosciences的公司的聯(lián)合創(chuàng)始人，該公司正在將DETECTR商業(yè)化。

該發(fā)現(xiàn)將于10月18日在“ 科學(xué) ”雜志上的印刷出版之前在線報道。Doudna是霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員和創(chuàng)新基因組學(xué)研究所的聯(lián)合主任。Banfield是IGI的微生物學(xué)領(lǐng)導(dǎo)者。

采礦宏基因組

Cas14蛋白是由聯(lián)合第一作者Harrington和現(xiàn)任以色列特拉維夫大學(xué)教授David Burstein發(fā)現(xiàn)的，因為他們在過去15年由加州大學(xué)伯克利分校同事創(chuàng)建的微生物基因組數(shù)據(jù)庫中尋找Cas變體。由地球與行星科學(xué)和環(huán)境科學(xué)，政策與管理教授Jill Banfield領(lǐng)導(dǎo)的團隊。通過對來自各種外來環(huán)境的樣品中的所有DNA進行宏基因組測序，獲得數(shù)萬個基因組。在從科羅拉多州Rifle的有毒凈化場所獲得的地下水樣品中測序的古細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了Cas14。

兩年前，Harrington和Burstein在挖掘宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn)了其他小Cas蛋白，CasX和CasY。

Cas14的長度為CasX的400-700個氨基酸的一半，小于所有其他已知的Cas系統(tǒng)，其長度范圍為950-1,400個氨基酸。

“偶然，我們發(fā)現(xiàn)這些非常小的蛋白質(zhì)，其他人只是扔掉了，因為它們看起來不像以前已知的CRISPR系統(tǒng)。它們太小了，”哈靈頓說。“我們決定，哎呀，讓我們試一試。我們測試了它，我們真的很震驚地發(fā)現(xiàn)這些是真正的功能系統(tǒng)。”

在數(shù)據(jù)庫中找到Cas14的基因只是一個開始。迄今為止，大多數(shù)Cas蛋白已在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，因此在標(biāo)準(zhǔn)實驗室細(xì)菌大腸桿菌中發(fā)揮良好作用。但是Cas14來自古細(xì)菌 - 一群最小的古細(xì)菌，叫做DPANN。所有Cas蛋白都含有一些RNA用于靶向和結(jié)合，但Cas14不能與CRISPR-Cas9 RNA一起使用，因此該團隊還必須從數(shù)據(jù)庫中捕獲Cas14必須存在的兩個RNA才能發(fā)揮作用。

此外，DPANN Archaea不能在實驗室中種植 - 它們似乎是寄生的或在某種程度上依賴于其他較大的古菌 - 因此研究人員必須在試管中創(chuàng)造合適的環(huán)境。

Harrington說，與其在更原始的微生物中的起源一致，細(xì)長的Cas14似乎是更大和更復(fù)雜的Cas9和Cas12蛋白的更原始的版本，暗示這些分子已經(jīng)進化到更長時間以更加專業(yè)化。研究人員希望從這種原始的Cas蛋白中學(xué)習(xí)，Cas蛋白是Cas酶的必需成分，因此他們可以設(shè)計出最緊湊，最時尚的基因切割器。

哈靈頓指出，宏基因組采礦發(fā)現(xiàn)了Cas14的各種版本，可能被證明是有用的生物技術(shù)工具。“一個令人驚奇的事情......就是這些系統(tǒng)的多樣性，”他說。“我們已經(jīng)描述了40多種新的CRISPR-Cas14系統(tǒng)和8種不同的亞型。這為研究這些新的CRISPR系統(tǒng)開辟了閘門。”