來自加州大學舊金山分校和麻省理工學院和哈佛大學的研究所的研究人員已經(jīng)開發(fā)出一種新方法，用于對復雜的遺傳相互作用進行高通量功能篩選，并在單細胞中產生表型，他們將其稱為“Perturb-seq”。這些發(fā)現(xiàn)可以大大加快科學家繪制基因相互作用和對環(huán)境刺激的反應的能力，從而促進對健康基因網(wǎng)絡的理解以及它們在疾病背景下如何出錯。

在12月15日出版的Cell雜志上發(fā)表了兩篇合著論文，其中一篇由Broad研究所研究人員領導，另一篇由UCSF研究人員領導，Perturb-seq平臺使用單細胞RNA測序來測量許多基于CRISPR的擾動的影響。在大量的細胞上。該方法可用于許多實驗應用，例如比以前可能更有效地探索基因組研究中遺傳風險因子的功能影響，或者觀察癌細胞中突變的基因。

通過協(xié)作，Broad和UCSF團隊使用Perturb-seq分別對樹突狀細胞中的免疫反應，免疫系統(tǒng)中作為關鍵信使的細胞類型以及未折疊的蛋白質反應(細胞應激)進行了新的發(fā)現(xiàn)。與許多神經(jīng)退行性疾病有關的途徑，證明該平臺有可能產生對各種生物學問題的洞察力。

“在perturb-Seq中，我們將匯集的CRISPR篩選與基于液滴的單細胞RNA測序的信息豐富的讀數(shù)結合起來，為我們提供了一個強大的工具，可以顯著增加我們從功能基因組篩選中學到的關于電路如何學習的范圍廣泛領導的研究的高級作者，麻省理工學院的生物學教授，Broad的核心教員，霍華德休斯醫(yī)學研究所的研究員，Aviv Regev博士說。“特別是，我們可以理解'整體是如何大于其各部分的總和'，也就是說，為什么將兩個不同的基因混合在一起會產生不同于單獨擾動它們的效果。這將有助于我們更好地預測當我們開發(fā)治療方法時，我們會以疾病為目標。“

“Perturb-seq帶來了兩項技術進步 - 基于CRISPR的擾動和大規(guī)模并行單細胞RNA測序 - 我們認為這將極大地加速我們理解編碼細胞組分的不同基因如何通常連接在一起的能力加州大學舊金山分校的細胞和分子藥理學教授，霍華德休斯醫(yī)學研究所的研究員，以及加州大學舊金山分校領導的研究的高級作者喬納森韋斯曼博士說，這是人類疾病出了什么問題。

還采用了強大的細胞條形碼策略的設計，使研究人員能夠識別事后在合并實驗中對細胞進行的特定擾動，同時測量這些擾動對細胞中mRNA轉錄物的影響。 。在進行實驗性處理(例如免疫刺激或細胞應激)后，可以對細胞進行基于液滴的單細胞RNA測序，以讀出轉錄譜和條形碼的同一性。通過索引細胞的mRNA和條形碼同一性，每個細胞的轉錄譜與傳遞給它的一個或多個遺傳擾動相關。

“功能基因組學研究可以揭示基因型和表型之間的聯(lián)系，但我們也想了解兩者之間的機制關系，”廣泛領導的研究的共同第一作者，研究生Atray Dixit說。麻省理工學院。“觀察RNA水平是一個很好的起點。”

在廣泛領導的實驗中，研究人員使用CRISPR / Cas9核酸酶切割DNA并使參與樹突狀細胞免疫應答的轉錄因子蛋白(TF)的基因失活，并使癌細胞系中TF和細胞周期調節(jié)因子的基因失活。 。Perturb-seq準確地鑒定了受個體基因修飾影響的個體基因靶標，基因特征和細胞狀態(tài)，并探索了這些基因如何相互作用和相互依賴。

“在過去，功能性屏幕必須在測量由許多擾動引起的簡單表型變化之間進行選擇，或者在有限數(shù)量的擾動中采用豐富，高分辨率的觀察，”Oren Parnas博士說，他的共同第一作者廣泛領導的研究，曾是Broad研究所的博士后研究員，目前是耶路撒冷希伯來大學醫(yī)學院的研究員。“有了Perturb-seq，我們可以在兩端擴大實驗范圍。”

在UCSF主導的實驗中，研究人員使用基于CRISPR的轉錄干擾(CRISPRi)同時抑制癌細胞系中的三個基因并研究未折疊蛋白反應(UPR)，這是一種眾所周知的質量控制途徑，可以感知壓力在內質網(wǎng)(ER)中，許多細胞的關鍵蛋白質被制成。UPR檢測細胞蛋白質生產機器中的錯誤，并確保受損細胞自我毀滅。

在全基因組CRISPRi篩選中鑒定出數(shù)百個功能由UPR監(jiān)測的基因后，由UCSF領導的團隊應用Perturb-seq以單細胞分辨率查詢這些基因的一個子集，使研究人員能夠系統(tǒng)地揭示這些關系在基因之間解剖細胞對ER應激反應的復雜方式。

“通過單細胞RNA測序得到的無偏讀數(shù)，我們可以在沒有事先假設的情況下發(fā)現(xiàn)有關生物途徑的信息，”加州大學舊金山分校領導的研究的共同第一作者，博士后研究員Tom Norman博士說。魏斯曼實驗室 “它開辟了新的可能性，從更有針對性的研究中可能并不明顯。”

Perturb-seq方法可用于研究致病等位基因的功能效應，并可大規(guī)模探索可以修改以逆轉這些效應的其他目標。該方法也很有效，因為它允許同時研究幾種擾動，這可以為尋找癌癥中的聯(lián)合療法提供信息。

“通過共同努力建立核心技術，然后同時努力評估Perturb-seq和基于CRISPR的方法來滅活或抑制生物學不同領域的基因，我們的團隊能夠迅速證明該系統(tǒng)具有廣泛的適用性，”加州大學舊金山分校領導的研究的共同第一作者，Weissman實驗室的博士后研究員Britt Adamson博士說。“Perturb-seq不僅限于一種類型的CRISPR介導的擾動，這一事實應該令人難以置信，并允許其他研究小組利用這種新方法。”

研究人員表示，他們希望這兩項細胞研究能夠成為他們新平臺的有力例證，隨著單細胞測序技術的進步和未來的強大功能，Perturb-seq可能會變得更加容易和快速，日益強大的研究可以揭示基因及其在健康和疾病中的相互作用。