最重要的是，建造一些東西比撕毀它更難。同樣地，敲除基因比敲除它們帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。這是一個(gè)現(xiàn)實(shí)，研究人員必須克服，以充分利用基因編輯。敲除基因使科學(xué)家能夠研究特定基因變異的影響，使用綠色熒光蛋白等報(bào)告基因在時(shí)間和空間上追蹤基因產(chǎn)物，探測(cè)基因組調(diào)控，最終修復(fù)導(dǎo)致疾病的基因。“這是一種非常有效的方法來(lái)詢問(wèn)基因的每個(gè)基因，” 華盛頓大學(xué)的博士/博士候選人Greg Findlay說(shuō)。

CRISPR-Cas9是一種以其用戶友好性著稱的基因編輯技術(shù)，可以將基因敲入或敲出。敲除基因涉及使用引導(dǎo)RNA將CRISPR-Cas9插入細(xì)胞，所述引導(dǎo)RNA將工具靶向感興趣的基因。在那里，Cas9切割基因，剪斷兩條DNA鏈，并且細(xì)胞的常規(guī)DNA修復(fù)機(jī)制使用稱為非同源末端連接(NHEJ)的過(guò)程修復(fù)切割。NHEJ高效但不準(zhǔn)確。該過(guò)程傾向于以小插入或缺失的形式引入錯(cuò)誤，這通常足以敲除基因。

然而，為了敲除基因，必須非常精確地修復(fù)切口，沒(méi)有額外的插入或缺失。這需要利用稱為同源定向修復(fù)(HDR)的第二種DNA修復(fù)機(jī)制，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中至少發(fā)生效率較低，因此其頻率與NHEJ相比相形見(jiàn)絀。使該過(guò)程進(jìn)一步復(fù)雜化的事實(shí)是一些基因座和細(xì)胞類型本質(zhì)上不太適合CRISPR-Cas9編輯。

在過(guò)去幾年中，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多新策略來(lái)提高使用CRISPR-Cas9敲除大小基因的效率，以及他們提出并測(cè)試這種基因編輯的新應(yīng)用的方式。在這里，科學(xué)家 探索了一些最有希望的方法。

選擇它

研究員： 賽默飛世爾科技公司合成生物學(xué)研發(fā)高級(jí)主管 Jon Chesnut

項(xiàng)目：在開(kāi)發(fā)Thermo Fisher將于今年晚些時(shí)候投放市場(chǎng)的名為Truetag的基因標(biāo)記試劑盒時(shí)，Chesnut使用可選標(biāo)記來(lái)提高

效率。選擇標(biāo)記 - 在這種情況下，抗生素抗性基因 - 粘附在熒光蛋白標(biāo)簽上并敲入

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。然后將這些細(xì)胞與相關(guān)的抗生素一起培養(yǎng)?？剐曰蛸x予攜帶它的細(xì)胞選擇性優(yōu)勢(shì); 它們只能生長(zhǎng)，因此生長(zhǎng)的那些含有感興趣的基因標(biāo)簽。即使基因插入的效率很低，研究人員也可以使用一周或更長(zhǎng)時(shí)間的抗生素選擇，最終成功插入高比例的細(xì)胞。

使用抗生素嘌呤霉素或殺稻瘟素與試劑盒，Chesnut的團(tuán)隊(duì)設(shè)法在一些細(xì)胞群中將基因插入率從10-30%提高到90%或更高。一些特別困難的基因從插入率小于1%到大于90%。在您計(jì)劃用于尋找正確劑量的細(xì)胞系上測(cè)試多劑抗生素非常重要，Chesnut說(shuō)：您希望在沒(méi)有插入的情況下殺死細(xì)胞，而不是在插入成功的情況下殺死細(xì)胞。

嘗試它：當(dāng)感興趣的基因高度表達(dá)時(shí)，可選擇的標(biāo)記最有效，Chesnut說(shuō)。“如果不是，你可能仍然可以選擇，但你可能無(wú)法獲得足夠的熒光蛋白標(biāo)簽表達(dá)以便能夠檢測(cè)到它。”此外，CRISPR-Cas9的一般限制也適用。“基因組中有一些區(qū)域與CRISPR切割效果不佳，我們?nèi)匀徊淮_定原因，”他補(bǔ)充道。并且一些細(xì)胞類型不容易接受外源DNA，RNA或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物 - CRISPR-Cas9遞送的三種方法。

為了更好地插入選擇標(biāo)記，確保有一個(gè)所謂的PAM [Protospacer Adjacent Motif]序列，它是CRISPR-Cas9切割前必須識(shí)別的靶DNA中的短標(biāo)簽，位于所需基因插入位點(diǎn)的10個(gè)堿基對(duì)內(nèi)，Chesnut說(shuō)。離切割位置更遠(yuǎn)，插入效率可能太低而無(wú)法正常工作。沒(méi)有PAM站點(diǎn)，您可以嘗試使用TALEN或鋅指核酸酶，盡管那些較老的基因編輯技術(shù)比CRISPR更難。

定時(shí)抑制

研究員： Jacob Corn，蘇黎世瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院基因組生物學(xué)家

項(xiàng)目：研究人員不明白為什么NHEJ途徑在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)HDR途徑。“酵母做HDR就像瘋了一樣，”Corn說(shuō)。為了加速人類細(xì)胞中的DNA修復(fù)過(guò)程并改善基因敲入控制，他和他的團(tuán)隊(duì)正試圖確定HDR的調(diào)控方式。他們篩選了人類細(xì)胞中的基因，這些基因的敲除導(dǎo)致細(xì)胞中HDR增加，然后搜索這些基因的小分子抑制劑。其中一個(gè)基因出現(xiàn)了CDC7，一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)渡到S期的激酶; 其抑制劑XL413可將基因敲入效率提高兩到三倍( BioRXiv，DOI：10.1101 / 500462,2018)。這是因?yàn)镠DR只發(fā)生在細(xì)胞周期的某些部分，包括S期，Corn說(shuō)。如果您在使用CRISPR-Cas9編輯目標(biāo)基因的同時(shí)添加抑制劑XL413，則細(xì)胞會(huì)在S階段之前的階段堆積。然后你移除XL413，所有細(xì)胞都進(jìn)入S階段，提高了敲入效率。

玉米在許多永生化的人細(xì)胞系和人類T細(xì)胞中使用了這種技術(shù)。它可以敲入短鏈DNA，如SNP，以及大基因。他說(shuō)，沒(méi)有理由不應(yīng)該在老鼠身上發(fā)揮作用，盡管他沒(méi)有對(duì)它進(jìn)行測(cè)試。

試一試： “時(shí)間絕對(duì)是關(guān)鍵，”Corn說(shuō)。Cas9必須在添加X(jué)L413的同時(shí)切割DNA。如果您在使用CRISPR-Cas9進(jìn)行編輯時(shí)首先進(jìn)行抑制然后釋放，則同源重組效率會(huì)下降三倍而不是增加，因?yàn)榧?xì)胞會(huì)釋放到細(xì)胞周期的錯(cuò)誤階段。

與任何HDR努力一樣，Corn表示，總是運(yùn)行無(wú)核酸酶控制，以確保您不會(huì)意外地放大在實(shí)驗(yàn)室中漂浮的污染DNA。他說(shuō)，在引入敲入后，“序列，序列，序列，序列”。只需使用熒光蛋白標(biāo)簽等報(bào)告系統(tǒng)來(lái)證明成功插入基因就可能適得其反。測(cè)序驗(yàn)證插入是在正確的位置進(jìn)行的。

玩長(zhǎng)游戲

研究員： 內(nèi)布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中心小鼠基因組工程核心設(shè)施主任 Channabasavaiah Gurumurthy

項(xiàng)目： 幾年前，Gurumurthy和他的同事們?cè)谠噲D將這些基因敲入基因的過(guò)程中考慮進(jìn)入小鼠受精卵時(shí)有一個(gè)啟示。

研究人員成功地插入了短鏈單鏈DNA，為什么不嘗試通過(guò)插入長(zhǎng)的單鏈DNA進(jìn)行敲入?實(shí)際上，Gurumurthy稱之為Easi-CRISPR(使用ssDNA插入物-CRISPR的有效添加物)的方法將效率提高了2.5倍，并且使用單鏈DNA在細(xì)胞培養(yǎng)中削減了脫靶插入率100倍(Nat Protoc) 13：195-215,2018; Nature 559：405-09,2018)。“這是非常巨大的，”他說(shuō)。在Gurumurthy的實(shí)驗(yàn)室中，Easi-CRISPR已經(jīng)為他們嘗試過(guò)的每10個(gè)基因中的9個(gè)產(chǎn)生了一個(gè)敲入式鼠標(biāo)系。合作者還在人類T細(xì)胞中使用它來(lái)制造CAR-T細(xì)胞，這是一種用于對(duì)抗癌癥的患者特異性免疫細(xì)胞。

嘗試一下： Gurumurthy警告說(shuō)，Easi-CRISPR遠(yuǎn)非萬(wàn)無(wú)一失。有時(shí)該技術(shù)僅插入部分基因。此外，他補(bǔ)充說(shuō)，它可以擾亂同源臂 - 基因任一側(cè)的短序列，將其置于基因組中的正確靶標(biāo)。并且一些基因座比其他基因座更難以插入。

很少有商業(yè)供應(yīng)商設(shè)計(jì)和合成定制的長(zhǎng)鏈單鏈DNA。你可以自己做，但單鏈DNA的穩(wěn)定性各不相同; Gurumurthy說(shuō)，不太穩(wěn)定的序列會(huì)產(chǎn)生較低的產(chǎn)量，因此你可能需要合成更多的序列。

Gurumurthy說(shuō)，無(wú)法將CRISPR插入單細(xì)胞小鼠胚胎的研究人員可以為核小鼠提供核心設(shè)施。核心設(shè)施，例如他從5,000美元到15,000美元的費(fèi)用，以產(chǎn)生一對(duì)或兩對(duì)繁殖對(duì); 他說(shuō)，商業(yè)設(shè)施收費(fèi)2萬(wàn)至5萬(wàn)美元。

數(shù)字敲門

研究員： Greg Findlay，華盛頓大學(xué)Jay Shendure實(shí)驗(yàn)室的博士/博士候選人

項(xiàng)目： 芬德利和他的同事們的目標(biāo)是改善臨床醫(yī)生如何解釋乳腺癌和卵巢癌基因BRCA1的突變。該基因有數(shù)千種變異，但研究人員并不知道它們中的大多數(shù)會(huì)影響其功能。為了研究這些變體的影響，他們使用了他們開(kāi)發(fā)的稱為飽和基因組編輯的敲入技術(shù)( Nature，562：217-22,2018)。

在永生化單倍體人細(xì)胞系中，他們使用CRISPR-Cas9在體外一次敲入數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中的4,000個(gè)微小變體?；蚪M在每個(gè)細(xì)胞中的相同位置切割，但每個(gè)細(xì)胞的基因組接收不同的變體。為了促進(jìn)HDR，他們還敲除了連接酶4Findlay說(shuō)，該基因阻礙了NHEJ修復(fù)途徑 - 這一步驟使效率提高了三倍。最后，由于所有細(xì)胞的敲入不同，它們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了深度測(cè)序，覆蓋了相同的基因組區(qū)域數(shù)百萬(wàn)次，以確保它們實(shí)際上敲入了他們想要研究的4,000種變體。他們?cè)趦蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，并推斷出在第二時(shí)間點(diǎn)測(cè)序中未出現(xiàn)的敲入物是干擾基因功能的敲入物，因?yàn)閿y帶它們的細(xì)胞必定已經(jīng)死亡。

嘗試一下： Findlay的團(tuán)隊(duì)在微陣列上為他們制造了4,000種變體的DNA寡核苷酸。Findlay表示，你可以購(gòu)買6,000到250,000個(gè)寡核苷酸的陣列，因此可以考慮通過(guò)在同一陣列上組合多個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得更多收益。他們的實(shí)驗(yàn)室為100,000個(gè)寡核苷酸支付了大約5,000美元。

該策略具有局限性：迄今為止僅用于敲入單核苷酸變體，并且所有編輯都需要在同一基因中。Findlay說(shuō)，當(dāng)編輯相當(dāng)狹窄的DNA區(qū)域(大約110-120個(gè)堿基對(duì))時(shí)，該方法效果最佳，因?yàn)檩^長(zhǎng)的DNA寡核苷酸會(huì)產(chǎn)生太多錯(cuò)誤。同樣重要的是要非常深入地排序以確保您考慮到您想要敲入的全部變體。