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      CRISPR研究人員開發(fā)精確 無(wú)模板基因組編輯的方法
      
			
      
				2019-07-04 08:47:07
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      通過(guò)創(chuàng)建機(jī)器學(xué)習(xí)算法，預(yù)測(cè)人類和小鼠細(xì)胞如何響應(yīng)CRISPR誘導(dǎo)的DNA斷裂，由Broad研究所和布萊根婦女醫(yī)院的研究人員領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞通常以精確的方式修復(fù)破碎的基因。可預(yù)測(cè)的，有時(shí)甚至將突變的基因恢復(fù)到健康的版本。此外，研究人員將這種預(yù)測(cè)能力用于測(cè)試并成功糾正了患有兩種罕見遺傳疾病之一的患者細(xì)胞的突變。
      

      CRISPR研究人員開發(fā)精確 無(wú)模板基因組編輯的方法
      

      非同源末端連接(NHEJ)和微同源介導(dǎo)的末端連接(MMEJ)過(guò)程是涉及修復(fù)Cas9介導(dǎo)的雙鏈斷裂的主要途徑，其可導(dǎo)致包含數(shù)百種修復(fù)基因型的高度異質(zhì)性修復(fù)結(jié)果。雖然已經(jīng)利用Cas9介導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂的末端連接修復(fù)來(lái)促進(jìn)DNA模板的敲入或兩個(gè)切割位點(diǎn)之間的間插序列的缺失，但NHEJ和MMEJ通常被認(rèn)為不適用于精確基因組編輯應(yīng)用，研究人員指出
      

      他們開發(fā)了高通量化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9)介導(dǎo)的修復(fù)結(jié)果分析，以基于人類基因組的序列特征使用1,872個(gè)靶位點(diǎn)表征Cas9誘導(dǎo)的雙鏈斷裂的末端連接修復(fù)產(chǎn)物。
      

      然后，他們使用得到的指導(dǎo)RNA庫(kù)來(lái)訓(xùn)練他們?cè)诘聽柗泼臋C(jī)器學(xué)習(xí)模型，以預(yù)測(cè)5種人和小鼠細(xì)胞系中高至1至60堿基對(duì)缺失和1堿基對(duì)插入的基因型和頻率。 。InDelphi預(yù)測(cè)，5%至11%的針對(duì)人類基因組的Cas9指導(dǎo)RNA將成為研究人員所稱的“精確50” - 產(chǎn)生的單一基因型占所有主要編輯產(chǎn)品的50%以上。
      

      通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)，他們證實(shí)195個(gè)人類疾病相關(guān)等位基因的精確-50插入和缺失，包括將致病等位基因的原發(fā)性患者衍生成纖維細(xì)胞修正為Hermansky-Pudlak綜合征的野生型基因型，導(dǎo)致血液凝固缺乏和白化病，和門克斯病，導(dǎo)致銅缺乏。
      

      他們使用德爾福設(shè)計(jì)14種gRNA進(jìn)行高精度無(wú)模板編輯，在內(nèi)源性人類疾病相關(guān)基因座中產(chǎn)生可預(yù)測(cè)的1-bp插入基因型，并在兩種人類細(xì)胞系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)高度精確的編輯。“我們使用德爾菲揭示人類致病等位基因，這些等位基因是有效和精確的無(wú)模板功能獲得基因型校正的候選者，并且在野生型基因型中獲得了183個(gè)致病性人類微復(fù)制等位基因的無(wú)模板校正，≥50%編輯產(chǎn)品，“作者寫道。“最后，我們整合這些發(fā)展，以實(shí)現(xiàn)人和小鼠細(xì)胞中五種致病性低密度脂蛋白受體(LDLR)微復(fù)制等位基因的高精度校正，
      

      重要的是，研究人員得出結(jié)論，預(yù)測(cè)Cas9介導(dǎo)的產(chǎn)品的能力可以實(shí)現(xiàn)新的精確基因組編輯研究應(yīng)用并促進(jìn)現(xiàn)有應(yīng)用，例如執(zhí)行有效的雙等位基因敲除和預(yù)測(cè)HDR的末端連接副產(chǎn)物。
      

      此外，他們發(fā)現(xiàn)抑制NHEJ增強(qiáng)了病原微復(fù)制等位基因的修復(fù)，這表明臨時(shí)操作DNA修復(fù)途徑可以與Cas9介導(dǎo)的編輯相結(jié)合，以高精度地支持特定的編輯基因型。研究人員還認(rèn)為，如果在德爾菲獲得適當(dāng)?shù)挠?xùn)練數(shù)據(jù)，它還可以學(xué)習(xí)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其他設(shè)計(jì)師核酸酶的修復(fù)基因型。
      
			

			
        
      
			
      
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