在這次采訪中，AZoNetwork向Knauer講述了FPLC在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用，以及它的產(chǎn)品如何使科學(xué)家獲得最多的液相色譜;由Matthew Rafferty駕駛。

FPLC是一種快速蛋白液相色譜法，是一種用于從生物分子中提煉蛋白質(zhì)的技術(shù)。所建立的一般系統(tǒng)類似于制備小分子的HPLC，通常由洗脫液泵、樣品噴射器、便于實(shí)際純化的柱和檢測器組成。在傳統(tǒng)的高效液相色譜中，紫外/VIS是檢測信號(hào)最常用的技術(shù)。在FPLC中，紫外檢測器與導(dǎo)電性和pH檢測器相結(jié)合，不僅可以監(jiān)測洗脫的樣品，還可以監(jiān)測所使用的阻尼器。FPLC的目標(biāo)通常是將分離的生物分子收集成餾分。這可以手動(dòng)驅(qū)動(dòng)，但主要由分?jǐn)?shù)收集器自動(dòng)化。

圖1:簡化FPLC的建立

主要的區(qū)別可以在名稱中找到。高壓液相色譜(HPLC)是在UHPLC系統(tǒng)中1200 bar的高壓下進(jìn)行的，而FPLC主要是在30 bar以下的低壓下進(jìn)行的。這是由于生物分子和柱狀基質(zhì)的脆弱性，它們只在低壓下穩(wěn)定。

另一個(gè)主要區(qū)別是FPLC中使用的溶劑。為了蛋白質(zhì)的純化，人們使用鹽阻尼器來防止生物分子的變性。傳統(tǒng)高效液相色譜中使用的有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)的原生結(jié)構(gòu)。在使用鹽阻尼器時(shí)，不使用不銹鋼是至關(guān)重要的，因?yàn)椴讳P鋼主要用于HPLC系統(tǒng)，因?yàn)楦g可能發(fā)生。另一個(gè)大的不同是FPLC執(zhí)行通常在4°C阻止變性的目標(biāo)分子。在設(shè)計(jì)FPLC系統(tǒng)時(shí)，必須考慮所有這些參數(shù)。

圖2:FPLC中使用的主要方法。

凈化方法由系統(tǒng)中使用的柱定義。在FPLC中，四種主要方法是尺寸排除色譜(SEC)、親和力色譜(AC)、離子交換色譜(IEX)和疏水相互作用色譜(HIC)。

大小排除色譜是根據(jù)生物分子的大小分離生物分子。第二柱的介質(zhì)由多孔顆粒組成。較小的分子可以在這些孔隙中擴(kuò)散，并被媒體保留更長的時(shí)間，而較大的生物分子幾乎不相互作用，因此不會(huì)首先洗脫。

利用一種特定的蛋白質(zhì)親和力柱介質(zhì)進(jìn)行純化，稱為親和力色譜法。目標(biāo)分子在柱中部的特定卡住執(zhí)行一個(gè)由三個(gè)階段組成的協(xié)議:加載、清洗和洗脫。在此過程中，具有柱介質(zhì)特定強(qiáng)制性質(zhì)的分子與所有剩余污染物分離。

另一方面，在離子交換色譜中，生物分子是根據(jù)其在特定pH下的電荷分離的，在疏水色譜中，生物分子是根據(jù)其疏水性相互作用分離的。

可耐爾FPLC投資組合的基本原則是活力、靈活性、可升級性和德國制造的最小足跡。AZURA FPLC是生物相容性的(自由金屬)，可以在寒冷的房間中操作。多種功能，如通過自動(dòng)陳列自動(dòng)注入樣品，柱開關(guān)，減震器和樣品的選擇，以及分?jǐn)?shù)的收集，使用戶能夠自動(dòng)化凈化過程。大量不同的探測器使目標(biāo)分子可見。所有供應(yīng)商的列的不同流量和兼容性提供了最大的靈活性。

客戶不必?fù)?dān)心在購買特定系統(tǒng)時(shí)陷入僵局。相反，他們可以根據(jù)自己的需要更換或升級系統(tǒng)，使用簡單而獨(dú)特的部件，如額外的泵或開關(guān)閥。

特別是在色譜系統(tǒng)中，閥門是一個(gè)被低估的部件。然而，如果你仔細(xì)想想，一個(gè)正確位置的閥門可以產(chǎn)生巨大的效果，例如幫助您的凈化過程自動(dòng)化，或者允許可選的反流凈化步驟更有效地清洗柱。

圖3:靈活的系統(tǒng)尺寸

2018年10月，我們將預(yù)包裝的FPLC柱添加到我們的投資組合中，非常適合我們的AZURA生物凈化系統(tǒng)。我們?yōu)榄傊呛陀倚堑挠H和力、離子交換和平均大小排除色譜提供了Sepapure柱和大多數(shù)材料。預(yù)包裝的FPLC柱可作為1 ml和5 ml墨盒使用，兼容標(biāo)準(zhǔn)10 - 32窺視UFN連接。所有ca柱均由100個(gè)μm瓊脂糖顆粒固定的粘合劑組成，抗體結(jié)合能力< 15 mg/ml (ProteinG)，抗體結(jié)合能力< 30 mg/ml(蛋白A)，標(biāo)記蛋白結(jié)合能力< 40 mg/ml(其標(biāo)簽)，標(biāo)記蛋白結(jié)合能力< 10 mg/ml (GST標(biāo)簽)。IEX柱也是基于100個(gè)μm瓊脂糖顆粒，電荷結(jié)合劑和離子容量< 0.12 mmol/ml。

簡而言之，我們很自豪能夠?yàn)榭蛻籼峁┩暾能浖?從應(yīng)用程序到硬件和軟件的完美解決方案。

通過自由組合設(shè)備和閥門，客戶可以根據(jù)應(yīng)用程序完全定制他們的系統(tǒng)，而不必妥協(xié)。KNAUER總是很高興為特定的凈化任務(wù)設(shè)置完美的解決方案。此外，AZURA的生物凈化系統(tǒng)可以很容易地?cái)U(kuò)展，這樣系統(tǒng)就可以隨著遇到的任務(wù)而生長。

我們提供一種高度通用的FPLC軟件PurityChrom，它非常適合生物尿液分析領(lǐng)域的應(yīng)用，因?yàn)樗且环N基于體積的色譜軟件。該軟件單獨(dú)提供了一個(gè)功能可調(diào)的系統(tǒng)可視化，即使在復(fù)雜的設(shè)置下也可以直觀地手動(dòng)操作FPLC。由于FPLC和PurityChrom的安裝非常靈活，我們的客戶可以為復(fù)雜的方法編寫方法，并讓用戶完全控制凈化。

您可以在我們的Web頁面https://www.knauer.net/en/Systems-Solutions/FPLC上找到大量信息，以及我們的FPLC手冊和我們在實(shí)驗(yàn)室中使用KNAUER FPLC系統(tǒng)運(yùn)行的許多應(yīng)用程序。