萊斯大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種計算模型來量化CRISPR-Cas9蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)其基因組編輯目標(biāo)的機(jī)制?；瘜W(xué)和化學(xué)和生物分子工程的Rice教授和校友AlexeyShvets的Anatoly Kolomeisky改編了他們之前開發(fā)的系統(tǒng)，以顯示蛋白質(zhì)通常如何找到它們的生物靶標(biāo)。他們希望修改后的模型能夠幫助解開CRISPR的其余奧秘。

在其天然狀態(tài)下，CRISPR代表“聚集有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)”，是細(xì)菌保護(hù)自身免受病毒感染的生物學(xué)機(jī)制。這些細(xì)菌包含了一份外國DNA，并建立了所有入侵者的記錄。它們在檢測到新入侵者時引用該記錄并使用它來銷毀它們。

近年來，研究人員已開始調(diào)整基因組編輯中使用的機(jī)制，該機(jī)制具有治愈疾病和增強(qiáng)包括人類在內(nèi)的生物體的潛力。但是，使用CRISPR方法的系統(tǒng)之一CRISPR-Cas9蛋白將切割并替換錯誤的靶序列，引入突變，這是一個絆腳石。

生物物理雜志中描述的Rice模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)允許這些脫靶編輯發(fā)生時，CRISPR-Cas9可能更有效地定位良好的靶標(biāo)，因為蛋白質(zhì)不會浪費(fèi)時間與脫靶相關(guān)以繼續(xù)搜索。

Kolomeisky說，這可能是也可能不是一件好事，但它肯定值得研究。

“錯誤率(脫靶率)有時是10-20%，”他說。“我們有兩個想法：一個是病毒變異非?？?，也許細(xì)菌試圖削減只是稍微突變的目標(biāo)，以便更靈活。另一個是有蛋白質(zhì)可以糾正錯誤，所以如果錯誤的削減并不多，系統(tǒng)可以容忍它們。

Kolomeisky說，他的模型是一個簡單的步驟，可以找出CRISPR編輯的動態(tài)。“CRISPR-Cas9是最受歡迎的變種，因為它只含有一種蛋白質(zhì)，在生物學(xué)上更容易使用，”他說。

萊斯實驗室開發(fā)了其原始模型，以了解蛋白質(zhì)如何沿著DNA滑動以找到目標(biāo)并觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄等過程。Kolomeisky指出，CRISPR先驅(qū)Jennifer Doudna發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9不會以同樣的方式尋找。“她發(fā)現(xiàn)DNA不會在任何地方滑動，”他說。

相反，根據(jù)Doudna和她的團(tuán)隊，蛋白質(zhì)最初識別三核苷酸PAM(用于原型間隔相鄰基序)序列，標(biāo)記潛在靶標(biāo)的位置。“CRISPR發(fā)現(xiàn)并結(jié)合PAM，然后其相關(guān)的RNA探索相鄰的DNA，看看它是否是目標(biāo)，”Kolomeisky說。“如果是的話，蛋白質(zhì)會開始減少。如果沒有，它會解除分離，并尋找其他地方。”

在Doudna隨后刪除PAM序列的實驗中，CRISPR-Cas9蛋白根本找不到它們的靶標(biāo)。因此，PAMs具有重要作用，而不僅僅是一個通用的間隔物，他說。“一旦我讀到這篇文章，我就知道我們也可以在這里使用我們的模型。”

理論模型著眼于第一次通過過程 - 當(dāng)系統(tǒng)超過物理或化學(xué)閾值時發(fā)生的那些過程，例如找到相關(guān)的PAM來跟蹤插入到細(xì)胞中的CRISPR-Cas9蛋白，因為它們首先調(diào)查PAM序列，然后結(jié)合到PAMs，搜索與Cas9 RNA相匹配的DNA靶標(biāo)。

他們發(fā)現(xiàn)，通過與“錯誤”DNA分離而避免脫靶的切割的CRISPRs比需要切斷目標(biāo)的DNA需要更長時間才能解決。“走向錯誤的PAM需要時間，”Kolomeisky說。“我們的計算結(jié)果表明，當(dāng)有時會在錯誤的地方切割時，CRISPR可以更快地找到真正的目標(biāo)。進(jìn)入正確目標(biāo)的部分可能會更小，但最終會削減它們。

“這是一個簡單的模型，完全可以解決，”Kolomeisky說。“如果有人想測試，該模型可以提供具體的預(yù)測，并在某些情況下提供應(yīng)該觀察的趨勢。”模型中遺漏的是能夠看到RNA密鑰是否同時識別其靶標(biāo)同時與DNA結(jié)合 - 或者依次與核苷酸核苷酸結(jié)合。

“關(guān)于CRISPR的最令人印象深刻的事情不是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)，而是在生物技術(shù)領(lǐng)域創(chuàng)造了一場革命，因為它意味著在任何細(xì)胞中我們都能在特定位置切割任何DNA，非常精確，”科洛梅斯基說。“我希望我們的工作能夠激發(fā)更多的基礎(chǔ)研究，因為我非常喜歡CRISPR方法。但是當(dāng)人們應(yīng)用它而不理解它在分子水平上如何工作時，我感到不快樂。”

Shvets現(xiàn)在是麻省理工學(xué)院的博士后研究員。Kolomeisky是化學(xué)和化學(xué)與生物分子工程的教授。