通過正確的改進，CRISPR基因編輯系統(tǒng)可以徹底改變基因治療。例如，CRISPR需要引入更少的脫靶效應，更不用說有害的目標效應。但即使CRISPR達到目標并發(fā)揮預期效果，仍存在另一個問題：效率。幸運的是，德州大學西南醫(yī)學中心的科學家們報告說，CRISPR的效率可能很容易提高。只需調(diào)整關(guān)鍵CRISPR成分 - Cas9蛋白和指導RNA(gRNA)的劑量即可。

美國西南部大學的科學家在為Duchenne肌營養(yǎng)不良癥(DMD)進行基因治療時，采用了簡單的提高效率的策略。通過反復試驗，科學家們發(fā)現(xiàn)，使用10比1的gRNA與Cas9比例可以對關(guān)鍵DMD基因缺陷進行最佳編輯，即外顯子44缺失突變。科學家們認為，與1：1的比例相比，10比1的效率提高了約10倍。

科學家工作的詳細研究結(jié)果發(fā)表在3月6日的科學進展雜志上，題為“ CRISPR-Cas9糾正小鼠和人類細胞中Duchenne肌營養(yǎng)不良癥外顯子44缺失突變 ”的文章。文章描述了科學家如何糾正外顯子44在患者衍生的誘導多能干細胞中以及在具有相同缺失的新小鼠模型中缺失。雖然目前的研究主要集中在DMD，但該研究的結(jié)果可能對優(yōu)化DMD以外疾病的基因治療產(chǎn)生影響。

“使用AAV9編碼Cas9和單一指導RNA，我們還證明了這些基因編輯組分的劑量對于體內(nèi)最佳基因校正的重要性，”該文章的作者寫道。“我們還表明，單個指導RNA出乎意料地限制了體內(nèi)最佳基因編輯，并且通過優(yōu)化編碼Cas9和單一指導RNA的AAV的劑量，編輯效率可提高~10倍。”

由埃里克奧爾森博士，教授和分子生物學主席領導的UT西南科學家開發(fā)了一種方法，通過將Cas9加載到腺病毒相關(guān)病毒(AAV)中來編輯肌營養(yǎng)不良蛋白基因的缺陷部分，這是一種無害的病毒。將編輯組件傳遞到單元格中。還將指導RNA加載到AAV中以將Cas9引導至其突破DNA的突變。

編輯過程繞過突變并使肌纖維產(chǎn)生肌營養(yǎng)不良蛋白，Olson在大型哺乳動物，小鼠和人類細胞的先前研究中記錄了陽性結(jié)果。

在這些研究中，研究小組使用標準的1比1的Cas9和指導RNA來幫助肌肉中的肌營養(yǎng)不良蛋白恢復至正常值的90%以上。

在針對該基因不同部分的新研究中，他們發(fā)現(xiàn)1比1的比例不起作用：肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生僅在輸送到血液中時恢復到正常值的5%。

科學家們發(fā)現(xiàn)，使用10比1的指導RNA與Cas9的比例可以對肌營養(yǎng)不良蛋白基因的特定片段進行最佳編輯。在CRISPR劑量的四周內(nèi)，在具有共同DMD突變的小鼠中約90%的肌肉和心臟纖維中恢復肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生。

“這是令人驚訝的，”該研究的第一作者Yi-Li Min說。“我們總是使用等量的兩種病毒來提供指導RNA和Cas9，并沒有考慮改變比例。”

DMD是男孩中最常見的致命遺傳疾病，導致肌肉和心臟衰竭，并在30年代早期導致過早死亡。隨著肌肉退化，患者被迫坐輪椅，最終因為膈肌減弱而進入呼吸器。盡管科學家們已經(jīng)知道，構(gòu)成長肌營養(yǎng)不良蛋白基因的79個外顯子中的任何一個缺陷都會導致這種情況，但是沒有有效的治療方法存在。

Olson發(fā)表了多項研究，他的實驗室在DNA的戰(zhàn)略要點進行單一切割以糾正突變。包括他最新研究的重點是刪除外顯子44，他的實驗室已經(jīng)創(chuàng)建了針對DMD患者中五種最常見缺陷的CRISPR技術(shù)，占全球約一半的病例。外顯子44的臨床治療，其位于該基因上最常見的突變熱點之一，可使約12%的患者受益。

這些技術(shù)尚未被批準用于臨床，但是Olson的團隊在發(fā)表一項科學研究顯示外顯子51的CRISPR編輯阻止了狗的DMD進展后，去年朝著這個目標邁出了重要的一步。

在基因編輯的幾周內(nèi)，缺失的蛋白質(zhì)在整個身體的肌肉組織中恢復，包括心臟中92%的校正和膈肌的58%，這是呼吸所需的主要肌肉?？茖W家估計需要15%的閾值才能顯著幫助患者。

該實驗室正在對狗進行長期研究，以測量肌營養(yǎng)不良蛋白水平是否保持穩(wěn)定，并確?；蚓庉嫑]有不良副作用。

Olson希望下一步超越狗只是一項臨床試驗，這將是UT西南大學的基因治療計劃旨在在未來幾年推出以解決許多致命的兒童疾病。

“在我們臨床使用之前，我們還有更多工作要做，”奧爾森說，“但看到我們走了多遠，我們感到非常興奮。”

“當我們在肌營養(yǎng)不良蛋白基因的其他缺陷部位檢測CRISPR時，調(diào)整我們的公式以獲得最佳結(jié)果可能很重要，”Olson補充說。“這種新的見解進一步促進了CRISPR作為Duchenne療法的應用，也許還有許多其他疾病。”