牛蜱由殺蟲劑控制，總是導(dǎo)致抗性菌株的選擇。在巴西，這種寄生蟲目前對(duì)牛農(nóng)使用的所有商業(yè)殺蟲劑或多或少都有抵抗力。最廣泛用于控制牛蜱種群(以及人寄生蟲)的抗寄生蟲藥物是伊維菌素，一種廣譜驅(qū)蟲藥，殺螨劑和殺蟲劑。巴西的商業(yè)牛牛群總額在2017年2.177億的動(dòng)物，根據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)部。同年，巴西是世界上主要的牛肉出口國(guó)，運(yùn)輸總額達(dá)62.8億美元。

如果不是寄生蟲造成巨大的年度經(jīng)濟(jì)損失，這些數(shù)字甚至可能更高。據(jù)估計(jì)，2014年這一損失至少達(dá)到139億美元。換句話說(shuō)，寄生蟲在死亡率，體重減輕，生育能力受損和產(chǎn)量減少方面造成的損失是年出口值的兩倍多。

最嚴(yán)重的損害是由內(nèi)部寄生蟲引起的，例如腸胃蠕蟲，造成損失達(dá)71億美元(占總數(shù)的51%)。接下來(lái)是外來(lái)的寄生蟲，它們生活在牛的皮膚上或者去看它們喂食。沒(méi)有比南方牛蜱(Rhipicephalus(Boophilus)microplus)更多的損害，其損失總計(jì)32億美元(23.2%)。角蠅(Haematobia irritans)造成損失25億美元(18.3%)，而家蠅(Dermatobia hominis)，螺旋蠅(Cochliomyia hominivorax)和穩(wěn)定蒼蠅(Stomoxys calcitrans)造成的損失達(dá)10億美元(7.5%)。

最近在“ 科學(xué)報(bào)告 ”上發(fā)表的一篇文章介紹了一項(xiàng)研究，其中巴西研究人員隸屬于圣保羅大學(xué)生物科學(xué)研究所(IB-USP)的遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)系以及埃爾多拉多的DesidérioFinamor獸醫(yī)研究所(IPVDF)。 Sul(南里奧格蘭德州)確定了牛蜱對(duì)伊維菌素的抗性機(jī)制，伊維菌素是最常用于對(duì)抗R. microplus的藥物之一。

該研究得到了圣保羅研究基金會(huì) - FAPESP和國(guó)家科學(xué)和技術(shù)發(fā)展委員會(huì)(CNPq)的支持。

“當(dāng)蜱以動(dòng)物的血液為食時(shí)就會(huì)發(fā)生感染，因?yàn)樗鼤?huì)在唾液中含有抗止血，抗炎和免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的動(dòng)物接種動(dòng)物，”Tatiana Teixeira Torres說(shuō)，他與遺傳學(xué)家ValériaLesLe一起進(jìn)行了這項(xiàng)研究。 Gall和Guilherme Marcondes Klafke。

根據(jù)托雷斯的說(shuō)法，這些物質(zhì)可以改變宿主在咬傷周圍的生理機(jī)能，導(dǎo)致血液流失，免疫力和刺激性降低。“動(dòng)物因感染而受到的壓力導(dǎo)致它停止喂食，減肥并變得不那么肥沃，”她說(shuō)。

“伊維菌素作為一種叫做GABA的神經(jīng)遞質(zhì)的類似物，在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，”托雷斯說(shuō)。“在牛蜱的情況下，這種神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)結(jié)合并激活谷氨酸門控氯離子通道受體起作用，這些受體是無(wú)脊椎動(dòng)物專有的神經(jīng)受體。該藥物在分子水平起作用，與神經(jīng)肌肉接頭處的神經(jīng)元氯離子通道結(jié)合，阻斷神經(jīng)傳遞，使昆蟲的肌肉癱瘓并導(dǎo)致死亡。“

伊維菌素于1975年被發(fā)現(xiàn)，自1981年以來(lái)一直在商業(yè)上使用。在牛蜱的情況下，這意味著無(wú)數(shù)代的R. microplus已經(jīng)暴露于該藥物超過(guò)三十年，足夠長(zhǎng)的時(shí)間使昆蟲產(chǎn)生抗性。它。

根據(jù)Torres的說(shuō)法，R。microplus的幾種機(jī)制可能與其對(duì)伊維菌素的抗性有關(guān)，包括解毒或耐受毒物的生理能力。“解毒的代謝機(jī)制是由酶家族和特定蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，這些蛋白質(zhì)通過(guò)自然選擇機(jī)制起到了這種作用，”她說(shuō)。

缺乏這些酶和蛋白質(zhì)的蜱在伊維菌素存在下死亡，而產(chǎn)生所述物質(zhì)的蜱存活并產(chǎn)生更多的后代，從而形成伊維菌素抗性菌株。

托雷斯解釋說(shuō)，在物種中介導(dǎo)解毒作用的酶家族包括細(xì)胞色素P450，酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)。

“其他蛋白質(zhì)，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也通過(guò)ATP消耗將有毒物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外部，從而有助于解毒過(guò)程，”由FAPESP資助的托雷斯說(shuō)。

致命的生物測(cè)定

通過(guò)增加細(xì)胞色素P450，酯酶，GST和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性來(lái)進(jìn)行農(nóng)藥解毒在各種節(jié)肢動(dòng)物群中是眾所周知的，包括牛蜱R. microplus。

“在我們的研究中，我們研究了一種耐受伊維菌素抗性的微小孢子菌菌株的解毒機(jī)制，與一種對(duì)農(nóng)藥敏感的菌株相比，”托雷斯說(shuō)。

“我們使用致死時(shí)間生物測(cè)定法分析兩種菌株中的伊維菌素解毒作用，在阻斷所研究蛋白質(zhì)的酶或轉(zhuǎn)運(yùn)活性的抑制劑存在下，使伊維菌素的毒性作用占上風(fēng)，從而提高死亡率。”

該研究的目的是鑒定在多藥耐藥牛蜱株中伊維菌素解毒中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。為了測(cè)試這些蛋白質(zhì)對(duì)耐藥性的影響，研究人員使用了每個(gè)蛋白質(zhì)家族的特異性抑制劑，并比較了使用或不使用抑制劑治療伊維菌素所導(dǎo)致的死亡率。

抑制劑是能夠誘導(dǎo)改變以防止解毒活性的物質(zhì)：用于細(xì)胞色素P450的硫酸丁醚(PBO)，用于酯酶的S，S-三丁基磷酸三酯(DEF)，用于GST的馬來(lái)酸二乙酯(DEM)和環(huán)孢菌素A(CsA)對(duì)于ABC運(yùn)輸商。

在生物測(cè)定中使用兩種R. microplus菌株。敏感菌株是Mozo，最初來(lái)自烏拉圭，用于診斷拉丁美洲的耐藥性。它保持在IPVDF而不與殺螨劑接觸。

根據(jù)Torres的說(shuō)法，伊維菌素抗性菌株是Juarez，于2010年在圣保羅州的Jacareí市分離。它最初是從養(yǎng)牛場(chǎng)的雄性牛蜱中收集的，據(jù)報(bào)道，伊馬替丁無(wú)法控制蜱蟲種群。Juarez是一種多重耐藥菌株，除伊維菌素外，其他殺蟲劑的死亡率較低，如氯氰菊酯，雙甲脒，毒死蜱和氟蟲腈。在IB-USP進(jìn)行的研究?jī)H限于伊維菌素。

進(jìn)行兩個(gè)單獨(dú)的致死生物測(cè)定電池。第一個(gè)設(shè)計(jì)用于測(cè)量伊維菌素單獨(dú)對(duì)易感菌株Mozo和抗性菌株Juarez的致死作用。將大約100-150個(gè)蜱幼蟲置于紙包中，將其在含有伊維菌素的溶液中溫育10分鐘。

根據(jù)Torres的說(shuō)法，當(dāng)從溶液中取出包裝袋時(shí)，通過(guò)計(jì)算每次樣品中接觸伊維菌素后死亡的幼蟲百分比來(lái)測(cè)量死亡率。該測(cè)量在10分鐘，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)和24小時(shí)進(jìn)行。

“第一批致死時(shí)間生物測(cè)定的結(jié)果表明，單獨(dú)用伊維菌素治療幼蟲的反應(yīng)隨時(shí)間變化明顯不同，”托雷斯說(shuō)。

“暴露4小時(shí)后，敏感菌株[Mozo]的所有幼蟲都死亡，而抗性株[Juarez]幼蟲的死亡率僅達(dá)到40%。這一比例在暴露后24小時(shí)保持不變。殺死敏感菌株未能殺死抗性菌株。“

第二批生物測(cè)定法再次使用敏感和抗性菌株，但在這種情況下，致死溶液不僅含有伊維菌素，還含有阻斷解毒酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用的四種抑制劑之一。

所有四種抑制劑分別在1.88至30微摩爾(μM)的五種不同濃度下進(jìn)行測(cè)試，目的是在不存在伊維菌素的情況下確定抑制劑的理想(無(wú)毒)水平。一旦發(fā)現(xiàn)每種抑制劑的最高非致死劑量，它們分別與伊維菌素一起用于通過(guò)抑制來(lái)探索蛋白質(zhì)在抗藥性中的作用。

例如，如果酶負(fù)責(zé)伊維菌素解毒并導(dǎo)致抗性蜱株的死亡率降低，則其抑制將導(dǎo)致死亡率增加，其可達(dá)到與易感菌株的死亡率相似的水平。

研究人員發(fā)現(xiàn)，抑制所有四個(gè)蛋白質(zhì)家族都會(huì)不同程度地提高死亡率。“我們的研究結(jié)果顯示，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在Juarez菌株顯示的抗性中發(fā)揮了最重要的作用，”托雷斯說(shuō)。“當(dāng)它們被環(huán)孢菌素A抑制時(shí)，其死亡率與敏感菌株中觀察到的死亡率非常相似。使用其他抑制劑[PBO，DEF和DEM]也導(dǎo)致耐藥菌株的死亡率更高，但抑制酶發(fā)揮作用在解毒方面不太重要。“

在用抗性菌株(Juarez)進(jìn)行致死性生物測(cè)定期間，當(dāng)將幼蟲置于含有12μg的伊維菌素和環(huán)孢菌素A(CsA)的溶液中時(shí)獲得了最佳結(jié)果。

抗性幼蟲單獨(dú)接觸伊維菌素后，40%在4小時(shí)內(nèi)死亡，24小時(shí)內(nèi)死亡率相同，而接觸殺蟲劑加CsA導(dǎo)致3小時(shí)20分鐘內(nèi)死亡50%，24小時(shí)內(nèi)死亡率約100% 。

“有趣的是，當(dāng)暴露于伊維菌素與CsA結(jié)合時(shí)，抗性菌株50%死亡率的致死時(shí)間與暴露于單獨(dú)使用伊維菌素的Mozo(敏感菌株)50%死亡率的致死時(shí)間非常相似，證明幾乎完全逆轉(zhuǎn)Juarez菌株的抗性表型，“托雷斯說(shuō)。

“與暴露于伊維菌素和CsA組合的菌株相比，24小時(shí)后僅暴露于伊維菌素的菌株的死亡率增加60%，證明了CsA的協(xié)同作用。”

該結(jié)果提供了伊維菌素抗性R. microplus中解毒機(jī)制作用的證據(jù)，有助于了解伊維菌素抗性表型的分子基礎(chǔ)。

“這些知識(shí)可以幫助我們找到應(yīng)對(duì)伊維菌素在田間抗藥性的新策略，”托雷斯說(shuō)。“例如，我們測(cè)試的抑制劑或具有類似作用的其他分子可以包含在伊維菌素的商業(yè)配方中。”

研究的蛋白質(zhì)活性的差異可能是由編碼這些蛋白質(zhì)的基因的結(jié)構(gòu)，序列或表達(dá)中的易感和抗性菌株之間的差異引起的。作為同一個(gè)更廣泛項(xiàng)目的一部分，研究人員現(xiàn)在正在研究編碼序列中對(duì)這四個(gè)家族的基因的取代，以及它們表達(dá)水平的改變。

“這項(xiàng)分析將幫助我們確定基因功能與伊維菌素代謝抗性之間的因果關(guān)系，”托雷斯說(shuō)。