在一份關(guān)于科學(xué)進(jìn)步的新報(bào)告中，大韓民國藥理學(xué)，電氣與計(jì)算機(jī)工程，醫(yī)學(xué)，納米醫(yī)學(xué)和生物信息學(xué)系的許權(quán)權(quán)和跨學(xué)科研究人員評估了SpCas9的活性;化膿性鏈球菌的一種細(xì)菌RNA引導(dǎo)的Cas9 核酸內(nèi)切酶變體(一種可切割DNA進(jìn)行基因組編輯的細(xì)菌酶)。他們基于人類細(xì)胞文庫，使用了具有12,832個目標(biāo)序列的高通量方法來構(gòu)建深度學(xué)習(xí)模型并預(yù)測SpCas9的活性。

數(shù)據(jù)包含寡核苷酸(核苷酸或構(gòu)件)，該寡核苷酸包含靶序列對和相應(yīng)的指導(dǎo)序列以編碼單指導(dǎo)RNA(sgRNA)，該單指導(dǎo)RNA可以指導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合并切割特定的DNA序列以進(jìn)行基因組編輯。他們在SpCas9誘導(dǎo)的indel (插入或缺失)頻率的大型數(shù)據(jù)集上實(shí)施了基于深度學(xué)習(xí)的訓(xùn)練，以開發(fā)名為DeepSpCas9的SpCas9活動預(yù)測模型，該模型現(xiàn)已在線提供。當(dāng)團(tuán)隊(duì)針對獨(dú)立生成的數(shù)據(jù)集測試該軟件時(shí)，結(jié)果顯示出較高的泛化性能，即該模型可以適當(dāng)?shù)剡m應(yīng)以前看不見的新數(shù)據(jù)。

所述CRISPR-CAS原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)用作基因組編輯用工具的轉(zhuǎn)化研究在多種物種和潛在的細(xì)胞類型，包括人細(xì)胞，其中所述容量準(zhǔn)確地預(yù)測SpCas9酶的活性是很重要的。研究人員先前已經(jīng)開發(fā)了幾種計(jì)算模型，這些模型可以根據(jù)基因編輯細(xì)胞的表型變化數(shù)據(jù)集或基于中等大小的質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫(在細(xì)菌和其他細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移基因的載體)的庫對庫方法來預(yù)測SpCas9的活性。。但是，由于數(shù)據(jù)集的質(zhì)量和大小都不理想，因此這些模型的泛化性能受到限制。例如，模型預(yù)測的基因插入和缺失(indels)以創(chuàng)建功能性敲除模型(一種在實(shí)驗(yàn)室中的實(shí)驗(yàn)動物模型中使基因失活的方法)會導(dǎo)致假陰性。此外，這些SpCas9誘導(dǎo)的插入缺失頻率數(shù)據(jù)集也只是中等大小。

Kim等。此前曾報(bào)道，一個名為深學(xué)習(xí)型計(jì)算模型DeepCpf1預(yù)測不同的核酸內(nèi)切酶(從AsCpf1的活性氨基酸球菌種)具有較高的推廣性能。為此，他們使用了指導(dǎo)RNA編碼的慢病毒文庫，目標(biāo)序列對來生成稱為DeepCpf1的大型訓(xùn)練數(shù)據(jù)集。盡管使用類似的基于庫的方法來開發(fā)可預(yù)測 Cas9酶產(chǎn)生的插入缺失頻率的計(jì)算模型，但仍有大量Cas9誘導(dǎo)的頻率數(shù)據(jù)集尚待形成。

因此，科學(xué)家必須開發(fā)具有高泛化性能的Cas9活動預(yù)測計(jì)算模型。在這項(xiàng)工作中，金等人。通過修改之前開發(fā)的DeepCpf1方法以形成DeepSpCas9，生成了一個高通量模型來測試SpCas9誘導(dǎo)的成千上萬個靶序列的插入缺失頻率。DeepSpCas9 Web工具是基于深度學(xué)習(xí)的模型，可以以較高的泛化性能準(zhǔn)確預(yù)測SpCas9的活動。

Kim等。首先準(zhǔn)備了一個慢病毒(一個復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒亞家族，可以整合外源DNA)文庫，包含15656個指導(dǎo)RNA(gRNA)編碼和目標(biāo)序列對，用于SpCas9活性的高通量評估。該研究小組使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增了包含指導(dǎo)序列和靶序列對的寡核苷酸庫，并使用Gibson DNA組裝技術(shù)將它們克隆到慢病毒質(zhì)粒(用于在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因傳遞系統(tǒng))中。

研究人員采用兩步法切割質(zhì)粒，并在切割位點(diǎn)插入sgRNA支架序列以生成質(zhì)粒文庫。為了隨后形成細(xì)胞文庫，科學(xué)家用從質(zhì)粒文庫產(chǎn)生的慢病毒處理了人類胚胎腎細(xì)胞(HEK 293T)?，F(xiàn)在，每個細(xì)胞在其基因組中都包含一個合成靶序列，并表達(dá)了相應(yīng)的sgRNA。然后，科學(xué)家用編碼SpCas9的慢病毒處理細(xì)胞文庫，從而在靶序列上引起sgRNA定向的切割和插入缺失形成，其頻率取決于sgRNA的活性。為了測量插入缺失的頻率，科學(xué)家對目標(biāo)序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并對其進(jìn)行了深度測序?；诟咄繉?shí)驗(yàn)，Kim等人。生成了兩個數(shù)據(jù)集，用于訓(xùn)練和測試DeepSpCas9模型。

科學(xué)家在具有不同染色質(zhì)可及性(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾對基因轉(zhuǎn)錄的影響)的124個內(nèi)源靶位點(diǎn)上選擇了SpCas9活性，以測試整合的合成靶序列的插入缺失頻率是否與相應(yīng)內(nèi)源位點(diǎn)的插入缺失頻率相關(guān)。他們觀察到根深蒂固的靶位點(diǎn)和HEK細(xì)胞內(nèi)源性位點(diǎn)的插入缺失頻率之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。

研究團(tuán)隊(duì)接下來開發(fā)了一個精確的計(jì)算模型，以使用端到端深度學(xué)習(xí)框架形成DeepSpCas9并預(yù)測SpCas9的活動來預(yù)測大型數(shù)據(jù)集上的SpCas9的活動。對于基本模型架構(gòu)，他們使用了卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(CNN，類似于普通神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))，對于輸入序列，他們使用了30個核苷酸的序列，并使用一鍵編碼將其轉(zhuǎn)換為二維二進(jìn)制矩陣(將包含數(shù)字分類數(shù)據(jù)的列拆分為許多列)。為了了解模型選擇和訓(xùn)練的通用性能，該團(tuán)隊(duì)使用Spearman相關(guān)性進(jìn)行了10倍交叉驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)測量值與預(yù)測的Cas9活性水平之間的系數(shù)。

當(dāng)他們增加用于交叉驗(yàn)證的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的大小時(shí)，實(shí)驗(yàn)indel頻率和DeepSpCas9模型的預(yù)測分?jǐn)?shù)之間的平均Spearman相關(guān)系數(shù)穩(wěn)步增加到0.77。與以前用于SpCas9活動預(yù)測的傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)算法(如支持向量機(jī)(SVM)，AdaBoost(自適應(yīng)提升)，隨機(jī)森林和梯度增強(qiáng)回歸樹)相比，DeepSpCas9模型的Spearman相關(guān)性明顯更高?？傮w而言，DeepSpCas9在所有型號中均表現(xiàn)出最佳性能。

在以前的工作中，Kim等人?？紤]了染色質(zhì)可及性信息，以改善對內(nèi)源性靶位點(diǎn)AsCpf1酶活性的預(yù)測。他們試圖確定這些考慮因素是否還會改善SpCas9的活動預(yù)測。結(jié)果表明，與他們以前使用AsCpf1所做的努力相比，利用染色質(zhì)可訪問性信息進(jìn)行的微調(diào)僅能提高DeepSpCas9預(yù)測內(nèi)源位點(diǎn)插入缺失頻率的準(zhǔn)確性。因此，與先前開發(fā)的DeepCpf1算法形成鮮明對比的是，染色質(zhì)可訪問性僅對SpCas9活性產(chǎn)生了輕微影響。

為了了解DeepSpCas9的泛化性能，研究小組使用了足夠大的，已發(fā)布的，來自各種研究的數(shù)據(jù)集作為測試數(shù)據(jù)，對該模型進(jìn)行了測試。他們將結(jié)果與其他SpCas9活動預(yù)測程序(例如DeepCRISPR)的結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在用于預(yù)測SpCas9活性的9個已發(fā)布模型中，DeepSpCas9保持最高的泛化功能。這樣，Hui Kwon Kim和研究團(tuán)隊(duì)使用DeepSpCas9網(wǎng)絡(luò)工具(現(xiàn)已在線提供，連同補(bǔ)充代碼)廣泛驗(yàn)證了準(zhǔn)確預(yù)測SpCas9活動的潛力。提供給研究科學(xué)家將DeepSpCas9整合到現(xiàn)有模型中?；贒eepSpCas9的高泛化性能，研究團(tuán)隊(duì)希望能夠提高基于SpCas9的基因組編輯的準(zhǔn)確性。