加州大學(xué)伯克利分校和勞倫斯伯克利國家實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家發(fā)明了一種合成DNA的新方法，該方法有望更容易，更快，不需要使用有毒化學(xué)品，而且可能更準(zhǔn)確。

該技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性，可以產(chǎn)生比現(xiàn)今方法長10倍的DNA鏈。研究人員表示，易用性可能導(dǎo)致研究實(shí)驗(yàn)室中無處不在的“DNA打印機(jī)”，類似于當(dāng)今許多研討會中的3D打印機(jī)。

加州大學(xué)伯克利分校的研究生Dan Arlow說：“如果你是一名機(jī)械工程師，那么在你的商店里安裝一臺可以在一夜之間打印出一部分的3D打印機(jī)真的很不錯，所以你可以在第二天早上進(jìn)行測試。”“如果你是一名研究人員或生物工程師，并且你有一種簡化DNA合成的工具，'DNA打印機(jī)'，你可以更快地測試你的想法并嘗試更多新想法。我認(rèn)為這會帶來很多創(chuàng)新。”

Arlow和同事Sebastian Palluk是德國達(dá)姆施塔特工業(yè)大學(xué)的博士生，也是伯克利實(shí)驗(yàn)室的一名訪問學(xué)生，他們在6月18日在線出版并計劃在7月出版的Nature Biotechnology雜志上發(fā)表他們的新方法。他們和他們的同事在加利福尼亞州埃默里維爾的能源部聯(lián)合生物能源研究所進(jìn)行了這項(xiàng)研究。

“我個人認(rèn)為丹和塞巴斯蒂安的新方法可以徹底改變我們制造DNA的方式，”加州大學(xué)伯克利分?；瘜W(xué)和生物分子工程教授，伯克利實(shí)驗(yàn)室高級教員科學(xué)家和JBEI首席執(zhí)行官杰伊凱斯林說。

Palluk來自德國專門與Arlow一起研究Keasling實(shí)驗(yàn)室的DNA合成問題，該實(shí)驗(yàn)室一直是合成生物學(xué)領(lǐng)域的先驅(qū)。Keasling和JBEI科學(xué)家專門為微生物(主要是酵母和細(xì)菌)添加基因，以可持續(xù)的方式生產(chǎn)有用的產(chǎn)品 - 藥物，燃料，工業(yè)化學(xué)品，副產(chǎn)物毒性最低，能耗最低。

“我們相信，增加DNA結(jié)構(gòu)的使用將加速疾病新療法的開發(fā)，并簡化新藥的生產(chǎn)，”Palluk說。

40年的合成過程

合成DNA是一項(xiàng)不斷發(fā)展的業(yè)務(wù)，因?yàn)楣居嗁彾ㄖ苹颍虼怂麄兛梢栽谖⑸锎笸爸猩a(chǎn)生物藥物，工業(yè)酶或有用的化學(xué)物質(zhì)。研究人員購買合成基因以插入植物或動物或嘗試新的基于CRISPR的疾病療法。

一些科學(xué)家甚至提出將信息存儲在DNA中，就像今天存儲在計算機(jī)硬盤中的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)一樣，因?yàn)橐豢薉NA理論上可以存儲相當(dāng)于5000萬張DVD并且應(yīng)該穩(wěn)定幾個世紀(jì)。然而，這意味著合成比目前生物技術(shù)行業(yè)中使用的DNA鏈更多的DNA鏈。

所有這些應(yīng)用都要求合成過程忠實(shí)地產(chǎn)生所需的核苷酸或堿基序列 - DNA的構(gòu)建塊 - 在數(shù)百萬甚至數(shù)十億拷貝的DNA分子中。

目前的DNA合成，其歷史可以追溯到1981年，并且使用來自有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)，僅限于直接生產(chǎn)約200個堿基長的所謂寡核苷酸，因?yàn)殡S著長度的增加，該過程中的不可避免的錯誤導(dǎo)致正確序列的低產(chǎn)率。為了組裝一個小基因，科學(xué)家們必須在約200個堿基長的片段中逐步合成它，然后將它們縫合在一起。這是耗時的，通常需要多次嘗試，有時甚至完全失敗。

此外，當(dāng)從Twist Biosciences Inc.和Integrated DNA Technologies(IDT)等合成公司訂購時，一個約1,500個堿基長的小基因的周轉(zhuǎn)時間可能是兩周，成本為300美元，限制了研究人員可以進(jìn)行的基因調(diào)整數(shù)量。能夠嘗試和他們可以嘗試的速度。像Keasling，Arlow和Palluk這樣的合成生物學(xué)家經(jīng)常將十幾種不同的基因一次性插入微生物中，使其產(chǎn)生所需的化學(xué)物質(zhì)，每種基因都有其自身的合成問題。

“作為德國的一名學(xué)生，我參加了國際合成生物學(xué)競賽iGEM，在那里我們試圖讓大腸桿菌細(xì)菌降解塑料廢物。但我很快意識到，大部分研究時間都用于獲取所有的DNA一起，沒有做實(shí)驗(yàn)，看看工程細(xì)胞是否可以分解塑料。這真的促使我研究DNA合成過程，“Palluk說。

化學(xué)DNA合成還需要使用具有毒性的特定類型的活化DNA構(gòu)建塊，以及用石油衍生的溶劑洗滌的重復(fù)循環(huán)。Arlow說，廢物處理的問題以及由于對水分極其敏感而使該過程變得挑剔的事實(shí)是研究人員擺脫他們的個人寡核苷酸合成器并且現(xiàn)在由專業(yè)公司合成DNA的原因。

攻擊免疫系統(tǒng)

這項(xiàng)新技術(shù)依賴于在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的DNA合成酶，該酶天然具有向水中現(xiàn)有DNA分子添加核苷酸的能力，其中DNA最穩(wěn)定。該技術(shù)有望提高精確度，這可以使DNA鏈的合成時間延長10倍，或數(shù)千堿基長 - 中等大小基因的大小。

“我們已經(jīng)想出了一種合成DNA的新方法，它利用了大自然用來制造DNA的機(jī)器，”Palluk說。“這種方法很有前途，因?yàn)槊敢呀?jīng)進(jìn)化了數(shù)百萬年才能完成這種精確的化學(xué)反應(yīng)。”

細(xì)胞通常不會從頭開始合成DNA;它們大多是在許多不同的聚合酶的幫助下復(fù)制的，這些聚合酶基于細(xì)胞中已有的DNA模板。然而，在20世紀(jì)60年代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種不尋常的聚合酶，它不依賴于現(xiàn)有的DNA模板，而是隨機(jī)地將核苷酸添加到制造免疫系統(tǒng)抗體的基因中。這種酶被稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，在這些基因中產(chǎn)生隨機(jī)變異，因此得到的抗體蛋白能夠更好地靶向前所未見的入侵者。

Paldk說，TdT同樣可以很好地添加所有四種DNA核苷酸，沒有副反應(yīng)可能會破壞所產(chǎn)生的分子，并且非?？?，如果你讓它自由輪，每分鐘擴(kuò)展DNA大約200個堿基。

多年來，許多實(shí)驗(yàn)室試圖利用這種酶合成所需的DNA序列，但酶很難控制。關(guān)鍵要求是弄清楚如何使酶添加一個核苷酸然后停止，以便可以一次一個堿基合成所需的序列。所有先前的提議都試圖通過使用具有阻止多次添加的特殊阻斷基團(tuán)的修飾核苷酸來實(shí)現(xiàn)該控制。在DNA分子被封閉的核苷酸延伸后，除去封閉基團(tuán)以進(jìn)行下一次添加。

“這些方法與下一代測序技術(shù)有很多共同之處，”Palluk說，指的是用于讀取遺傳序列的最先進(jìn)技術(shù)，它通過使用模板依賴性聚合酶順序添加阻斷以不同顏色發(fā)熒光的核苷酸，表明添加了四種可能堿基中的哪一種。

雖然用于測序的DNA復(fù)制酶能夠在添加的核苷酸上容納阻斷基團(tuán)，但TdT不能。當(dāng)核苷酸正確定位用于反應(yīng)時，其反應(yīng)位點(diǎn)太緊以不適合阻斷基團(tuán)。

Arlow的想法是將未阻斷的核苷酸牢固地連接到TdT，以便在將核苷酸添加到生長中的DNA分子后，酶保持附著并且自身保護(hù)鏈的末端免于進(jìn)一步添加。在DNA分子延伸后，它們切斷連接系鏈以釋放酶并重新暴露末端以進(jìn)行下一次添加。

在他們的第一次試驗(yàn)中 - 使用工程化TdT酶創(chuàng)建10堿基寡核苷酸的10個循環(huán) - 伯克利研究人員表明，他們的快速和簡單技術(shù)在合成的每個步驟中幾乎與當(dāng)前技術(shù)一樣準(zhǔn)確。

“當(dāng)我們使用NGS分析產(chǎn)品時，我們能夠確定大約80%的分子具有所需的10堿基序列，”Arlow說。“這意味著，平均而言，每一步的收益率都在98%左右，這對于這個50多歲的問題首次出現(xiàn)并不算太糟糕。我們希望達(dá)到99.9%以便制造基因 - 長DNA。“

Palluk說，一旦它們達(dá)到99.9%的保真度，它們可以一次合成一個1000堿基長的分子，產(chǎn)率超過35%，這在目前的化學(xué)合成技術(shù)中是完全不可能的。

“通過直接合成較長的DNA分子，將寡核苷酸縫合在一起的需要以及這一繁瑣過程產(chǎn)生的局限性可以減少。我們的夢想是直接合成基因長度序列，并在幾天內(nèi)將它們送到研究人員，”他說。

“我們的希望是，該技術(shù)將使生物工程師更容易更快地找到如何生產(chǎn)有用產(chǎn)品的生物制造，這可能導(dǎo)致生產(chǎn)我們在世界上依賴的東西的更可持續(xù)的過程，包括服裝，燃料和食品，以一種需要較少石油的方式，“阿洛說。