杜克大學(xué)的研究人員已經(jīng)證明，使用CRISPR基因組編輯技術(shù)的單一系統(tǒng)治療可以安全，穩(wěn)定地糾正遺傳性疾病 - 杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD) - 在小鼠中使用超過一年，盡管觀察到免疫反應(yīng)和替代基因編輯結(jié)果。該研究于2月18日在線發(fā)表在“ 自然醫(yī)學(xué) ” 雜志上。

2016年，Duke的Rooney家族生物醫(yī)學(xué)工程副教授Charles Gersbach發(fā)表了一項成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動物模型的方法，其策略有可能轉(zhuǎn)化為人類治療。此后發(fā)表了許多其他的例子，針對人類疾病的幾種基因組編輯療法目前正處于臨床試驗階段，還有更多的例子。

Gersbach的最新研究重點是DMD的小鼠模型，這是由身體無法產(chǎn)生肌營養(yǎng)不良蛋白引起的，肌營養(yǎng)不良蛋白鏈?zhǔn)且环N將肌纖維內(nèi)部與周圍支撐結(jié)構(gòu)結(jié)合的長蛋白鏈。

抗肌萎縮蛋白由含有79個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的基因編碼，稱為外顯子。如果一個或多個外顯子被遺傳突變破壞或刪除，則鏈不會被構(gòu)建，導(dǎo)致肌肉慢慢撕裂并惡化。大多數(shù)患者在10歲時就坐輪椅，并且不能超過20歲或30歲出頭。

自2009年以來，Gersbach一直致力于Duchenne的潛在遺傳治療。他的實驗室是最早開始關(guān)注CRISPR / Cas9的實驗室之一，這是一種細(xì)菌防御系統(tǒng)的修改版本，可以對入侵病毒的DNA進行定位和切片。他的方法使用CRISPR / Cas9來剪切基因突變周圍的肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子，讓身體的天然DNA修復(fù)系統(tǒng)將剩余的基因重新縫合在一起，以創(chuàng)建一個縮短但功能性的肌營養(yǎng)不良蛋白基因。

“隨著我們繼續(xù)努力開發(fā)基于CRISPR的基因療法，測試我們的假設(shè)并嚴(yán)格評估這種方法的所有方面至關(guān)重要，”Gersbach說。“我們實驗的一個目標(biāo)是測試該領(lǐng)域正在討論的一些想法，這將有助于我們了解CRISPR一般治療遺傳性疾病和特別是Duchenne肌營養(yǎng)不良的潛力。這包括監(jiān)測反應(yīng)的長期耐久性面對針對細(xì)菌Cas9蛋白的潛在免疫反應(yīng)。“

第一個為期八周的研究表明功能性肌營養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)，肌肉力量增加。然而，它沒有探索治療的長期耐久性。

“人們普遍認(rèn)為，基因編輯會導(dǎo)致永久性基因修正，”Gersbach說。“但是，探索可能破壞基因編輯效果的理論可能性非常重要，例如失去處理過的細(xì)胞或免疫反應(yīng)。”

這項新研究的目的是探索可能改變基于CRISPR / Cas9的基因編輯的長期影響的因素。

領(lǐng)導(dǎo)這項工作的Gersbach實驗室的博士后研究員克里斯托弗·尼爾森(Christopher Nelson)對攜帶缺陷型肌營養(yǎng)不良蛋白基因的成年和新生小鼠靜脈內(nèi)施用單劑量的CRISPR療法。在接下來的一年中，研究人員測量了成功編輯了多少肌肉細(xì)胞以及進行了哪些類型的遺傳改變，以及針對細(xì)菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，Cas9充當(dāng)“剪刀”這削弱了基因組。

其他研究報道，小鼠免疫系統(tǒng)可以對Cas9產(chǎn)生反應(yīng)，這可能會干擾CRISPR療法的益處。一些研究小組還報告說，有些人對Cas9蛋白具有預(yù)先存在的免疫力，這可能是因為之前接觸過細(xì)菌宿主。

“好消息是，盡管我們觀察到抗體和T細(xì)胞對Cas9的反應(yīng)，但似乎都沒有在這些小鼠中產(chǎn)生任何毒性，”尼爾森說。“這種反應(yīng)也沒有阻止該療法成功編輯肌營養(yǎng)不良蛋白基因并產(chǎn)生長期蛋白質(zhì)表達(dá)的能力。”

結(jié)果還提出了解決潛在挑戰(zhàn)的方法，如果它們在未來出現(xiàn)的話。例如，研究人員觀察到，當(dāng)沒有完全發(fā)育免疫系統(tǒng)的2日齡小鼠進行靜脈內(nèi)治療時，沒有檢測到免疫反應(yīng)。CRISPR基因組編輯保持穩(wěn)定，在某些情況下甚至在一年內(nèi)得到加強。人們可以想象將治療作為一種規(guī)避或調(diào)節(jié)不需要的免疫反應(yīng)的方法給嬰兒。

然而，Gersbach和Nelson承認(rèn)，小鼠免疫系統(tǒng)的功能通常與人體免疫系統(tǒng)完全不同。新生兒DMD篩查目前尚未廣泛開展; 大多數(shù)Duchenne診斷發(fā)生在兒童三至五歲時。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，Gersbach說在治療期間抑制免疫系統(tǒng)可能是一種可行的方法。

研究人員還在研究限制Cas9僅在短時間內(nèi)表達(dá)或遞送至肌肉細(xì)胞的潛在策略，這可能會減少免疫檢測。

“我們很高興地觀察到所有小鼠在治療后一年都表現(xiàn)良好，但我們的研究結(jié)果表明，隨著我們向更大的動物模型邁進，需要更加關(guān)注免疫反應(yīng)，”尼爾森說。

Nelson和Gersbach此前曾調(diào)查過CRISPR / Cas9的脫靶編輯潛力，無意中修改了基因組中的其他位點，并報告了可能脫靶位點的最小活性。然而，最近的其他研究報道，CRISPR有時可以在正確的位點進行基因編輯，但不能以預(yù)期的方式進行。例如，一些研究表明，CRISPR可以切除比預(yù)期大得多的遺傳切片，或者DNA片段可以嵌入切割位點。之前在基因組編輯研究中未報告這些類型的編輯，因為所使用的方法僅檢測到預(yù)期的編輯。

為了全面地繪制肌營養(yǎng)不良蛋白基因中發(fā)生的所有編輯，Nelson使用了DNA測序方法，該方法無論何時都會報告任何類型的編輯。令人驚訝的是，除了目標(biāo)外顯子的預(yù)期去除之外，還進行了許多類型的編輯，包括從編碼CRISPR / Cas9系統(tǒng)的病毒載體中高水平插入DNA序列。

根據(jù)組織的類型和CRISPR遞送的劑量，多達(dá)一半的目標(biāo)編輯導(dǎo)致這些替代序列變化。盡管該結(jié)果令人驚訝，但是非預(yù)期的序列變化似乎不會影響該CRISPR / Cas9基因編輯方法對DMD的安全性或功效。

“在這種情況下，這些編輯都不一定引起關(guān)注，因為肌營養(yǎng)不良蛋白基因已經(jīng)存在缺陷，”尼爾森說。“話雖這么說，任何意想不到的結(jié)果都可能會剝奪你試圖實現(xiàn)的基因編輯的效率，這支持了設(shè)計在未來研究中客觀地識別和減輕替代編輯的方法的重要性。”

“以前的研究表明，其中一些類型的編輯可能會發(fā)生，”格斯巴赫說。“但這是使用治療相關(guān)方法對動物模型中這些事件進行的首次綜合測量之一。展望未來，需要仔細(xì)監(jiān)測這一現(xiàn)象并更好地理解。避免這些替代編輯并增加預(yù)期頻率的方法編輯對于最大限度地發(fā)揮基因組編輯治療疾病的潛力非常重要。“