中國醫(yī)學(xué)裝備2021年12月第18卷第12期ChinaMedicalEquipment2021DecemberVol.18No.12學(xué)術(shù)論著

基于超高壓液相譜評價不同保存時間

*對人血漿免疫球蛋白GN-糖基化水平的影響

張杰①孟曉妮①王碧妍①張曉雨①王友信①董晶②趙志強(qiáng)③*

[文章編號]1672-8270(2021)12-0153-05[中圖分類號]R446.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[摘要]目的：

探討超低溫環(huán)境下不同儲存時間對血漿免疫球蛋白G(IgG)N-糖基化水平的影響，以期為大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)

查中有效保存樣本提供幫助。

方法：

采用隨機(jī)數(shù)表法收集超低溫環(huán)境下(-80

℃)保存于2012年、2013年、2017年、2018年和

2019年5個年份的75份女性健康體檢的血漿樣本，并將其按照不同保存年限分為2012年組、2013年組、2017年組、2018年組

和2019年組。采用基于超高壓液相譜平臺，對5組血漿樣本中的總體IgGN-糖基化水平進(jìn)行高通量檢測，分離出24個糖基

結(jié)構(gòu)，并計算其衍生物結(jié)構(gòu)含量。采用方差分析或秩和檢驗(yàn)對不同儲存時間組的糖基檢測結(jié)果進(jìn)行差異性比較。

結(jié)果：

對

超低溫環(huán)境下不同保存時間保存的5組血漿樣本中IgGN-糖基結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，24個糖基結(jié)構(gòu)的檢測其譜峰(GP1～GP24)

均無統(tǒng)計學(xué)差異；對5組樣本中13個IgGN-糖基衍生物結(jié)構(gòu)含量比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論：

超低溫條件下，血漿樣本存

儲時間的長短對血漿中IgGN-糖基化水平未產(chǎn)生明顯的影響。

[

關(guān)鍵詞

]免疫球蛋白G(IgG)；N-糖基化；超高壓液相譜(UPLC)；糖基衍生物；儲存時間

DOI:10.3969/.1672-8270.2021.12.037

TheevaluationontheeffectsofdifferentstoragetimesonN-glycosylationlevelofimmunoglobulinGinhumanplasma

basedonUHPLC/ZHANGJie,MENGXiao-ni,WANGBi-yan,etal//ChinaMedicalEquipment,2021,18(12):153-157.

[Abstract]Objective:

ToinvestigatetheeffectsofdifferentstoragetimesontheN-glycosylationlevelofimmunoglobulin

G(IgG)ofhumanplasmaatultra-lowtemperature(-80

℃

)soastoprovidehelpforthepreservationofsamplesinlarge-

scaleepidemiologicalsurvey.

Methods:

Theplasmasamplesof75femaleswhowerehealthinphysicalexamination,

whichwerestoredin2012year,2013year,2017year,2018yearand2019year,wereselectedbyusingrandomnumber

yweredividedintogroup2012year,group2013year,group2017year,group2018yearandgroup

ra-performanceliquidchromatography(UPLC)wasadopted

toimplementhighthroughputtestforN-glycosylationlevelofIgGintheplasmasamplesof5groups.24glycosylation

structureswereisolated,ianceanalysisor

ranksumtestwereadoptedtoimplementdifferencecomparisonforthedetectionresultsofglycosylationatdifferent

storagetimes.

Results:

ThestructuresofIgGN-glycosylationintheplasmasamplesof5groups,whichwerestoredat

differentpreservationtimesunderultra-lowtemperature,werecompared,andthedifferencesofchromatographicpeak

(GP1-GP24)ferencesofthecontentsof13IgGN-glycosylation

derivativestructuresamong5groupswerenosignificant.

Conclusion:

Theintervalofstoragetimeoftheplasmasamples

hadnosignificanteffectontheIgGN-glycosylationlevelatultra-lowtemperature.

[Keywords]

ImmunoglobulinG(IgG);N-glycosylation;UPLC;Glycosylationderivative;Storagetime

[First-author’saddress]

BeijingMunicipalKeyLaboratoryofClinicalEpidemiology,SchoolofPublicHealth,Capital

MedicalUniversity,Beijing10069,China.

血漿免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)

N-糖基的特定譜型可及時反映機(jī)體多種生理和病理

改變[1]。異常的IgGN-糖基化水平，尤其是IgGN-

糖基衍生物半糖基化、唾液酸化、N-乙酰葡糖胺

化和核心巖藻糖基化的改變與高血壓、血糖異常、中

心性肥胖、血脂異常、代謝綜合征和缺血性腦卒中等

多種慢性疾病或其發(fā)生發(fā)展的危險因素存在關(guān)聯(lián)[2-4]。

目前，IgGN-糖基化水平的變化與多種慢性疾病發(fā)

生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性研究正在成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[5-8]。

低溫環(huán)境能長期保護(hù)樣本中生物大分子的信息完

整性，維持細(xì)胞和組織活性，可以為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究提供

保障[9]。然而，低溫保存對蛋白質(zhì)的影響比較大，長時

間暴露于降溫過程中可能會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不可逆轉(zhuǎn)

變[10]。為此，本研究通過對2012年、2013年、2017年、

2018年和2019年5個年份收集的健康體檢人血漿樣本

進(jìn)行IgGN-糖基化水平檢測，分析超低溫(-80℃)儲存

條件下儲存時間對人血漿IgGN-糖基化水平的影響，

以期為大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中樣本的保存提供幫助。

*基金項目：國家自然科學(xué)基金(81872682)“癡呆癥發(fā)生風(fēng)險分層的免疫球蛋白GN-糖基組生物標(biāo)志物篩選”

①首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院臨床流行病學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100069

②首都醫(yī)科大學(xué)附屬宣武醫(yī)院體檢科北京100053

③首都醫(yī)科大學(xué)信息中心北京100069

*通信作者：**************.cn

作者簡介：張杰，女，(1968-)，本科學(xué)歷，副主任，從事分子流行病學(xué)研究工作。

ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI153

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學(xué)術(shù)論著

1材料與方法

1.1儀器與試劑

中國醫(yī)學(xué)裝備2021年12月第18卷第12期基于超高壓液相譜評價不同保存時間

對人血漿免疫球蛋白GN-糖基化水平的影響*-張杰等

脫液移至新的96孔板中，用N-糖苷酶(N-glyeosidase

F)將與IgG結(jié)合的糖鏈消化下來；并用預(yù)冷的96%乙腈

將洗脫下來的糖鏈進(jìn)行純化；采用2-氨基苯甲酰胺

(2-aminobenzamide，2-AB)對洗脫下來的糖鏈進(jìn)行

熒光標(biāo)記。

(3)糖基結(jié)構(gòu)檢測。采用WatersAcquityH-Class

超高壓液相譜系統(tǒng)對2-AB標(biāo)記的IgGN-糖基進(jìn)行

檢測，熒光檢測器的激發(fā)光波長為330nm，發(fā)射光波

長420nm。

(4)IgGN-糖基計算。用不同譜峰對應(yīng)峰下面

積占所有譜峰峰下總面積的百分比表示，并進(jìn)行標(biāo)

準(zhǔn)化處理。

(5)糖基結(jié)構(gòu)鑒定。每個譜峰的含量被測定之

后，采用UPLC串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(quadrupole-

timeofflight-massspectrometry，quadrupole-TOF-

(6)糖基衍生物指標(biāo)含量的計算。在測得的24個

譜峰基礎(chǔ)上，根據(jù)糖基衍生指標(biāo)的方法[13]計算得到IgG

N-糖基衍生物：總核心巖藻糖結(jié)構(gòu)(Fuc)、總平分型

N-乙酰葡糖胺(N-GlcNAc)(Bis)、總半糖結(jié)構(gòu)(Gal)、

單半糖結(jié)構(gòu)(Gal-1)、總雙半糖結(jié)構(gòu)(Gal-2)、唾液

酸化結(jié)構(gòu)(Sal)、單唾液酸化結(jié)構(gòu)(Sal-1)、雙唾液酸化結(jié)

構(gòu)(Sal-2)、未唾液酸化的核心巖藻糖結(jié)構(gòu)(nFuc)、未唾

液酸化的平分型N-GlcNAc(nBis)、未唾液酸化的半

糖結(jié)構(gòu)(nGal)、未唾液酸化的單半糖結(jié)構(gòu)(nGal-1)和

未唾液酸化的總雙半糖結(jié)構(gòu)(nGal-2)，共計13種。

1.4評價指標(biāo)

觀察IgGN-糖基水平，對比分析不同保存時間

的血漿樣本中IgGN-糖基水平以及IgGN-糖基衍生

指標(biāo)含量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分

-

±

s

)表示，不滿足正布的計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(

x

(1)儀器設(shè)備。采用AcquityUPLC

1290型超高壓

液相譜儀器(美國Waters公司)；BEH譜柱，糖基

層析柱(美國Waters公司)；5430R小型高速離心機(jī)(德國

Eppendorf公司)；186001831型96孔板真空提取裝置(美

國Waters公司)；Concentratorplus型真空離心濃縮儀

(德國Eppendorf公司)；Milli-QAdvantageA10型純

水儀(美國Millipore公司)；4672100型八道電動移液

器(德國Eppendorf公司)；150μl進(jìn)樣瓶套管(上海沃

特世科技有限公司)；ULT-1385-3-V型超低溫冰箱

(美國ThermoFisher公司)。

(2)主要試劑。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(DextranCalibration

Ladder)(上海沃特世科技有限公司)；N-糖苷酶

(N-Glycosidase，100units，上海羅氏制藥有限公

Labelingkit，美國Sigma公司)；聚乙氧基乙醇辛

基苯基-聚乙烯二醇(Igepal)-CA630，美國Sigma公

司)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)(美國

Sigma公司)；甲酸(美國Sigma公司)；乙醇(譜級化

學(xué)純度＞99%，北京匯?？苾x科技有限公司)、異丙醇

(北京匯?？苾x科技有限公司)、Tris(三羥甲基氨基甲

烷，美國Sigma公司)；乙腈(譜級，北京匯?？苾x

科技有限公司)、甲酸銨(北京邁瑞達(dá)科技有限公司)。

1.2樣本收集

采用隨機(jī)數(shù)表法收集分別存放在-80℃超低溫環(huán)

境下，于2012年、2013年、2017年、2018年和2019年

5個年份收集并保存的首都醫(yī)科大學(xué)附屬宣武醫(yī)院健

康體檢的75名女性血漿樣本，且將其按照不同保存

年限分為2012年組、2013年組、2017年組、2018年組

和2019年組，每組樣本15份。5組體檢者總平均年齡為

(40.93±9.16)歲，年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可

比性。

1.3血漿IgGN-糖基檢測方法

根據(jù)已有文獻(xiàn)[11-12]報道的方法對血漿IgGN-糖基

化水平進(jìn)行定量檢測，該方法是一種基于96孔G蛋白

單片板的高通量、自動分析技術(shù)，其檢測步驟如下。

(1)血漿IgG提取及純化。將血漿樣本置于96孔蛋

白G提取板中，結(jié)合緩沖液清洗5次，以去除未結(jié)合的

蛋白。然后用甲酸溶液將IgG進(jìn)行洗脫，用96孔板進(jìn)

行收集并進(jìn)行濃度測定.

(2)IgG上糖鏈的釋放和標(biāo)記。將標(biāo)定濃度的IgG洗

154ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI

司)；糖蛋白2-AB標(biāo)記試劑盒(GlycoProfile2-ABMS)方法對定量后的糖基進(jìn)行具體結(jié)構(gòu)的定性。

態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，

符合正態(tài)分布的計量資料組間比較采用單因素方差分

析，不符合正態(tài)分布的計量資料組間比較采用非參數(shù)

秩和檢驗(yàn)，以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1IgGN-糖基的檢測結(jié)果

根據(jù)親水相互作用譜原理將不同結(jié)構(gòu)的IgGN-糖

基進(jìn)行分離，利用熒光檢測器最終分離得到24個不同的

譜峰(GP1～24)，每個峰代表1種糖基化結(jié)構(gòu)；其中

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對人血漿免疫球蛋白GN-糖基化水平的影響*-張杰等

學(xué)術(shù)論著

GP8包括GP8a和GP8b，GP16包括GP16a和GP16b，

見圖1。

2.2不同保存時間血漿樣本中IgGN-糖基水平比較

對不同保存時間的5組血漿樣本中IgGN-糖基的

24個糖基峰(GP1～24)中糖基結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，其結(jié)果

均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1-1和1-2。

2.3不同保存時間血漿樣本中IgGN-糖基衍生指標(biāo)含量比較

不同存放時間的5組血漿樣品中13種IgGN-糖基

圖1超高效液相分離出的IgGN-糖基結(jié)構(gòu)的24個譜峰圖

表1-1不同保存時間的5組樣本中IgGN-糖基化水平比較(

-

x

±

s

)

IgGN-糖基2012年組2013年組2017年組2018年組2019年組

F

值

P

值

GP20.34±0.110.39±0.160.31±0.220.35±0.150.31±0.195.9670.202

GP420.76±2.7622.53±3.2722.64±4.5921.77±3.9320.21±3.881.8970.121

GP50.24±0.080.25±0.070.24±0.070.24±0.110.24±0.101.0770.898

GP64.44±1.114.95±1.194.45±1.034.46±1.065.13±1.511.1550.338

GP74.49±0.164.42±0.214.41±0.174.43±0.224.40±0.183.3040.508

GP818.63±1.8318.04±2.1117.33±2.9218.26±2.1617.32±3.012.4680.053

GP110.48±0.160.44±0.250.42±0.300.43±0.210.41±0.150.2690.897

GP120.81±0.310.79±0.300.75±0.310.80±0.370.74±0.250.1360.969

GP1418.92±3.3118.25±3.1219.78±3.2519.81±3.3117.77±5.160.9050.466

GP151.66±0.351.61±0.321.87±0.281.66±0.311.63±0.121.9540.111

GP162.80±0.312.87±0.462.81±0.452.74±0.512.83±0.620.1340.969

GP1811.42±2.4711.27±3.3412.58±1.8211.34±3.2711.74±4.100.4560.768

GP191.49±0.271.43±0.371.42±0.391.45±0.431.40±0.480.1050.980

GP210.33±0.060.30±0.120.31±0.100.25±0.150.29±0.091.0910.368

GP220.10±0.030.11±0.070.12±0.120.12±0.060.11±0.080.2670.898

GP230.99±0.420.95±0.490.92±0.370.97±0.370.99±0.750.0590.994

GP241.04±0.270.88±0.420.92±0.510.98±0.490.98±0.620.240.915

注：表中GP為所有糖基峰下面積總和

表1-2不同保存時間的5組樣本中IgGN-糖基化水平比較[M(IQR)]

IgGN-糖基2012年組2013年組2017年組2018年組2019年組

H

值

P

值

GP10.07(0.08)0.08(0.09)0.08(0.07)0.08(0.06)0.05(0.08)1.4820.83

GP30.37(0.26)0.31(0.12)0.35(0.26)0.34(0.21)0.27(0.30)1.7480.782

GP98.95(1.20)8.43(2.53)7.51(4.25)7.59(3.64)7.68(3.61)4.2590.372

GP104.69(0.78)4.34(1.45)3.44(4.12)4.28(1.17)3.64(2.16)2.8410.585

GP130.47(0.08)0.50(0.22)0.39(0.32)0.44(0.18)0.35(0.32)3.7150.446

GP170.84(0.29)0.76(0.23)0.88(0.67)0.75(0.26)0.78(0.77)1.8070.771

GP200.03(0.010.04(0.08)0.03(0.070.06(0.030.03(0.073.9970.406

注：表中GP為所有糖基峰下面積總和

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155

學(xué)術(shù)論著

中國醫(yī)學(xué)裝備2021年12月第18卷第12期基于超高壓液相譜評價不同保存時間

對人血漿免疫球蛋白GN-糖基化水平的影響*-張杰等

-

±

s

)表2不同保存時間血漿樣本中IgGN-糖基衍生物含量比較(

x

IgGN-糖基衍生物

Fuc

Bis

Gal

Gal-1

Gal-2

Sia

Sia1

Sia2

nFuc

nBis

nGal

nGal-1

nGal-2

2012年組

94.36±5.18

14.51±1.52

73.38±4.10

35.97±1.95

37.41±3.79

18.35±2.61

16.61±2.61

1.74±0.43

97.04±0.57

14.68±2.11

68.89±3.14

40.58±2.93

27.31±3.18

2013年組

95.88±5.46

14.78±2.02

71.49±4.38

35.09±3.39

36.39±3.88

18.13±3.69

16.42±3.50

1.71±0.62

97.16±0.51

14.81±2.25

65.42±4.63

39.49±3.43

25.93±3.67

2017年組

96.93±7.21

14.13±2.43

72.859±5.11

33.47±3.27

39.38±4.16

19.38±1.96

17.71±1.77

1.67±0.42

97.39±0.56

14.14±2.67

65.94±4.19

37.79±3.24

28.15±3.96

2018年組

95.39±4.38

13.91±1.46

72.11±4.88

34.15±3.69

37.97±5.86

17.97±3.72

16.35±3.53

1.64±0.45

97.21±0.59

13.89±1.71

66.87±4.42

38.66±2.83

28.21±5.14

2019年組

91.41±5.6

14.96±2.31

68.97±7.78

33.22±3.59

36.76±7.39

18.53±4.28

16.82±3.91

1.71±0.77

97.28±0.52

16.11±3.19

65.93±5.59

38.43±3.86

27.49±5.91

F

值

2.554

0.432

1.935

3.004

0.917

0.385

0.452

0.067

0.784

1.007

1.490

2.864

0.648

P

值

0.052

0.785

0.114

0.054

0.459

0.811

0.771

0.992

0.539

0.410

0.215

0.051

0.631

注：表中Fuc為總核心巖藻糖結(jié)構(gòu)；Bis為總平分型N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)；Gal為總半糖結(jié)構(gòu)；Gal-1為單半糖結(jié)

構(gòu)；Gal-2為總雙半糖結(jié)構(gòu)；Sal為唾液酸化；Sal-1為單唾液酸化結(jié)構(gòu)；Sal-2為雙唾液酸化結(jié)構(gòu)；nFuc為未唾液酸化

的核心巖藻糖結(jié)構(gòu)；nBis為未唾液酸化的平分型N-乙酰葡糖胺；nGal為未唾液酸化的半糖結(jié)構(gòu)；nGal-1為未唾液酸

化的單半糖結(jié)構(gòu)；nGal-2為未唾液酸化的總雙半糖結(jié)構(gòu)

衍生指標(biāo)含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

3討論

N-糖基化(glycosylation)是蛋白質(zhì)翻譯后最普

遍的修飾形式之一，對蛋白質(zhì)生物學(xué)功能發(fā)揮著至

關(guān)重要的作用[14-15]

樣本，存儲時間長短對血漿中IgGN-糖基化水平未

產(chǎn)生明顯的影響，大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查中超低溫儲

存的樣本可以為后續(xù)的研究提供保障。

參考文獻(xiàn)

[1]

Vu

?

kovi

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F,Kri

?

ti

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J,GudeljI,ation

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化在IgG的結(jié)構(gòu)和功能中扮演著重要角，IgG其

Fc段上高度保守的N-糖基結(jié)構(gòu)的微小變化可以影響

Fc段的構(gòu)型，進(jìn)而改變甚至逆轉(zhuǎn)IgG的分子功能。

N-糖基末端唾液酸和半糖修飾水平，可以調(diào)節(jié)

IgG與Fc受體結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控炎癥通路，引發(fā)機(jī)

體抗炎與促炎狀態(tài)改變；如果IgGN-糖基缺少核心

巖藻糖修飾，可以使抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的毒作用

增強(qiáng)，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生[17]。因此，在大

規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查中檢測不同人的血漿樣本中

IgGN-糖基化水平對疾病的預(yù)防、發(fā)生和發(fā)展有著

重要的意義。

采用超高壓液相譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法，對超低溫

條件下(-80℃)不同保存時間的血漿樣本進(jìn)行IgGN-

糖基化水平高通量檢測，通過得到的特定譜峰型

對IgGN-糖基化水平進(jìn)行分析。由于血漿樣本中的

IgGN-糖基化水平因年齡、性別的不同而有所差異[18]。

4結(jié)論

在超低溫(-80℃)條件下存放的血漿樣本中IgG

N-糖基化結(jié)構(gòu)及其總衍生指標(biāo)的含量均未隨著存儲

時間的增長發(fā)生明顯變化。超低溫條件下儲存的血漿

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中國醫(yī)學(xué)裝備2021年12月第18卷第12期基于超高壓液相譜評價不同保存時間

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收稿日期：2021-03-27

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