當(dāng)研究人員談?wù)摽贵w時(shí)，他們想知道的第一件事就是抗體與其靶標(biāo)的結(jié)合程度 - 換句話說，它是多么具體。在商業(yè)研究公司Frost and Sullivan為The Scientist進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室抗體使用調(diào)查中， 84%的受訪者表示測(cè)量抗體特異性對(duì)他們的研究非常重要。

在實(shí)驗(yàn)室中使用抗體

了解The Scientist的讀者最喜歡哪些抗體供應(yīng)商，以及市場(chǎng)研究公司Frost&Sullivan的調(diào)查結(jié)果。

對(duì)于抗體特異性的表征，使用表面等離子體共振(SPR)的無標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)是王道。與ELISA或基于熒光的技術(shù)不同，這些系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)測(cè)量抗體和抗原以及其他結(jié)合配偶體(例如DNA和脂質(zhì))的結(jié)合和解離。因此，人們可以以非常快速的開啟和關(guān)閉速率研究抗體相互作用，從而研究低親和力。

“SPR技術(shù)作為一個(gè)整體，特別是Biacore，在靈敏度和通量方面具有最多選擇，”Regeneron Pharmaceuticals的科學(xué)家Matthew Blome說，他專門研究SPR和其他無標(biāo)記相互作用分析方法。

SPR在20世紀(jì)90年代初期以商業(yè)領(lǐng)域的形式出現(xiàn)，由GE醫(yī)療集團(tuán)生產(chǎn)的Biacore作為最常用的品牌。該儀器通過固定相互作用對(duì)中的一個(gè)成員來工作，稱為基質(zhì) - 在某些情況下是抗體 - 在薄金屬片上，通常是金。然后將樣品或目標(biāo)蛋白質(zhì)以不同濃度的溶液流過片材。儀器將光線照射到表面上，并根據(jù)光線反彈的角度測(cè)量其折射率(RI)。RI值根據(jù)芯片上分子的質(zhì)量而變化：當(dāng)樣品結(jié)合底物時(shí)RI增加，而當(dāng)樣品解離時(shí)RI返回基線。結(jié)合和解離的速率以及因此結(jié)合的動(dòng)力學(xué)和抗體親和力可以從RI隨時(shí)間的變化圖計(jì)算。

Blome說，SPR儀器，以及研究人員對(duì)如何使用該技術(shù)的理解，近年來已經(jīng)走過了漫長(zhǎng)的道路。 科學(xué)家與專家討論了他們?nèi)绾问褂肧PR來收集抗體結(jié)合的見解，同時(shí)克服實(shí)驗(yàn)挑戰(zhàn)。

Irwin Chaiken，德雷塞爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教授

項(xiàng)目

確定一種名為m18的HIV抗體是否通過與病毒包膜蛋白gp120上的相同表位結(jié)合來阻斷HIV感染，CD4受體是CD4受體，該病毒用于進(jìn)入(宿主)T細(xì)胞。

問題

通常，人們可能會(huì)將gp120粘附到金屬表面并在其上面流過CD4，然后用m18來分析m18是否與CD4或不同的CD4結(jié)合到gp120蛋白上的相同位置。但SPR讀數(shù)是分析物質(zhì)量的函數(shù)，在這種情況下解釋特別棘手，因?yàn)镃D4和m18的大小相似。

解決方案

Syna Kuriakose Gift與合作者一起，在Chaiken實(shí)驗(yàn)室的研究生期間，通過將gp120和CD4預(yù)混合在一起，然后將混合物流過固定化的m18底物，使實(shí)驗(yàn)成為可能。因此，只有當(dāng)CD4和m18在gp120上具有彼此遠(yuǎn)離的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，才會(huì)發(fā)生m18與gp120的結(jié)合。在2011年的一項(xiàng)研究中，研究小組發(fā)現(xiàn)gp120-CD4復(fù)合物未能結(jié)合錨定在芯片上的m18，這表明m18中和抗體可能通過與CD4競(jìng)爭(zhēng)gp120結(jié)合而發(fā)揮作用。

使用多組分系統(tǒng)比使用雙組分系統(tǒng)更難測(cè)量離解率。盡管預(yù)混合復(fù)合物在與配體結(jié)合期間可能保持完整，但它也可能在解離期間斷裂。“它是兩種解離現(xiàn)象的混合物，”Chaiken說。因此，您可以真正了解CD4和m18如何通過在雙組分SPR實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)測(cè)試來比較它們對(duì)gp120的親和力。

“蛋白質(zhì)不是巖石，gp120絕對(duì)不是巖石，”Chaiken說。響應(yīng)于與CD4的結(jié)合，gp120經(jīng)歷構(gòu)象變化，其增加其對(duì)HIV T細(xì)胞共同受體CCR5的親和力。在2011年的研究中，Chaiken的研究小組發(fā)現(xiàn)m18不會(huì)引發(fā)通常允許其進(jìn)入細(xì)胞的gp120的重要構(gòu)象變化，這解釋了為什么抗體如此有效。

檢測(cè)食品樣品中的細(xì)菌污染

研究員

Richard O'Kennedy，都柏林城市大學(xué)生物科學(xué)教授

項(xiàng)目

開發(fā)一種基于SPR的快速診斷系統(tǒng)，用于檢測(cè)不需要細(xì)菌培養(yǎng)的食品和飲料樣品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌，正如傳統(tǒng)的生化和血清學(xué)測(cè)試所做的那樣。

問題

從歷史上看，使用SPR檢測(cè)整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一直受到弱信號(hào)發(fā)射的困擾。部分挑戰(zhàn)是底物抗體將其表位定位在高度異質(zhì)的細(xì)胞表面上。

解決方案

通常使用“膠”將抗體固定在芯片上，所述“膠”使抗體定向并確保表位結(jié)合區(qū)在其流過芯片時(shí)面向樣品。然而，O'Kennedy的研究小組發(fā)現(xiàn)，他們可以通過將其分子與長(zhǎng)葡聚糖分子連接起來，使其李斯特菌抗體增強(qiáng)，使抗體更像是在溶液中移動(dòng)，從而促進(jìn)它們與難以到達(dá)的表位的結(jié)合，奧肯尼迪解釋道。此外，該小組確定了理想的抗體密度，O'Kennedy說，必須通過實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)結(jié)合對(duì)，以便含有多個(gè)相同抗原表位的細(xì)菌細(xì)胞可同時(shí)結(jié)合兩種抗體，從而增加SPR信號(hào)。

挑戰(zhàn)

全細(xì)胞大而且充電，因此存在可能堵塞SPR儀器中的管道的風(fēng)險(xiǎn)。O'Kennedy說，通常需要進(jìn)行優(yōu)化，例如降低分析物流過儀器的速度。他補(bǔ)充說，管道在Biacore模型之間有所不同。“Biacore 3000在檢測(cè)SPR信號(hào)時(shí)更敏感，但Biacore 1000在使用較大細(xì)胞時(shí)可能更好，因?yàn)樗哂休^低的堵塞機(jī)會(huì)。”

改進(jìn)的空間

在這種情況下，SPR需要能夠?qū)?xì)菌的存在給出是或否的讀數(shù)。在2006年的一項(xiàng)研究中，O'Kennedy的研究小組發(fā)現(xiàn)SPR可檢測(cè)到的單核細(xì)胞增生李斯特菌的最低濃度為107個(gè)細(xì)胞/ mL。然而，根據(jù)目前的食品政策，SPR必須在25克食物中鑒定單個(gè)細(xì)菌，這將意味著將1毫升食物中的單個(gè)細(xì)菌提取到溶液中用于SPR分析。“我認(rèn)為有可能達(dá)到更好的水平，”O'Kennedy說，通過進(jìn)一步修改抗體如何與芯片表面結(jié)合并開發(fā)出對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌具有更高親和力的抗體。

ID'ING ANTIBODY BIOMARKERS

研究員

Richard Van Duyne，西北大學(xué)化學(xué)教授

項(xiàng)目

檢測(cè)生物樣本中的淀粉樣蛋白-b低聚物 - 阿爾茨海默病的潛在診斷測(cè)試

問題

淀粉樣-B的肽鏈，或ADDL的，其被認(rèn)為在阿爾茨海默氏早期發(fā)揮作用，存在于非常低濃度-在飛摩爾范圍(10 -15)在腦脊液和大約10 -18在血液摩爾，范杜恩說。但檢測(cè)的抗體的極限是在皮摩爾范圍(10 -12最好的SPR條件下)。

解

Van Duyne的研究小組開發(fā)了一種他們稱之為局部SPR(LSPR)的方法，該方法利用納米粒子來提高靈敏度。他們用三角形銀納米粒子涂覆硅酸鹽芯片，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的電磁場(chǎng)，改變可見光的波長(zhǎng)，研究人員將其用作SPR讀數(shù)。當(dāng)在芯片上發(fā)生結(jié)合時(shí)，RI的變化影響電磁場(chǎng)并引起光波長(zhǎng)的強(qiáng)烈變化。為了進(jìn)一步放大信號(hào)，Van Duyne的小組用他們的LSPR進(jìn)行了“夾心測(cè)定”方法。他們?cè)诩{米粒子包被的芯片上捕獲實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的ADDL抗體，然后將抗體暴露于來自阿爾茨海默病患者的腦脊液(CSF)樣品，以允許樣品中ADDL的結(jié)合。最后，他們?cè)试S第二個(gè)ADDL抗體結(jié)合ADDL以增強(qiáng)LSPR讀數(shù)。Van Duyne說，當(dāng)?shù)诙€(gè)抗體結(jié)合時(shí)，它可以提供最佳的質(zhì)量增加，從而改變LSPR的讀數(shù)。使用此設(shè)置，該組設(shè)法檢測(cè)高飛摩爾范圍內(nèi)的ADDL。

挑戰(zhàn)

因?yàn)長(zhǎng)SPR的讀數(shù)是波長(zhǎng)而不是RI的變化，研究人員可以僅使用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡和CCD檢測(cè)器來檢測(cè)折射光的波長(zhǎng)，而不是SPR讀數(shù)，這是基于光強(qiáng)度。根據(jù)Van Duyne的說法，一個(gè)缺點(diǎn)是納米粒子涂層芯片和現(xiàn)成的LSPR儀器都沒有商用：“沒有公司可以在你做的時(shí)候握住你的手，而有SPR。”

改進(jìn)：簡(jiǎn)化夾層

可以通過將ADDL固定為基板來簡(jiǎn)化LSPR設(shè)置，以允許添加不同的CSF樣品而不犧牲靈敏度。在2011年的原理驗(yàn)證研究中，使用不同的靶蛋白和抗體，Van Duyne的研究小組表明，用第二種納米粒子標(biāo)記捕獲抗體或樣品抗體可將讀數(shù)的靈敏度提高三個(gè)數(shù)量級(jí)。Van Duyne說，相同的設(shè)置可用于檢測(cè)ADDL抗體的結(jié)合。

篩選高親和力單克隆抗體

研究員

Terry Pearson，加拿大維多利亞大學(xué)生物化學(xué)和微生物學(xué)教授，以及SISCAPA Assay Technologies，Inc。的CSO，該公司使用抗肽抗體和質(zhì)譜法測(cè)量生物標(biāo)記物

項(xiàng)目

鑒定對(duì)生物混合物中低濃度存在的肽具有高結(jié)合親和力的單克隆抗體。

問題

許多研究人員使用肽作為抗體結(jié)合底物，但這種方法充滿了并發(fā)癥。Pearson說，Y形抗體可以同時(shí)結(jié)合兩種肽，可以人工增加幾百倍的親和力測(cè)量值。

解決方案

Pearson和他的同事通過將他們想要篩選的單克隆抗體固定在芯片而不是肽上來解決這個(gè)問題。這種情況沒有親合力或來自抗體二價(jià)的影響 - 因?yàn)楸M管每種抗體仍然可以結(jié)合兩種肽，但肽在溶液中并且因此可以彼此獨(dú)立地締合和解離。

挑戰(zhàn)

通過結(jié)合小分子(如Pearson小組使用的1至2-kDa肽)獲得良好的SPR讀數(shù)比使用大分子(如抗體)獲得良好的SPR讀數(shù)更為棘手，因?yàn)镾PR信號(hào)與質(zhì)量直接相關(guān)。然而，保持SPR儀器清潔有助于他的團(tuán)隊(duì)獲得可靠的，如果低，SPR信號(hào)，Pearson說。

改進(jìn)：高通量篩選

為了鑒定可以檢測(cè)稀有肽的高親和力抗體，Pearson擴(kuò)大了這種方法，以便他每天可以篩選40個(gè)兔單克隆抗體克隆。為了提高通量，Pearson的研究小組使用“捕獲”抗體來阻斷單克隆抗體。他將“捕獲”抗體結(jié)合到芯片上，該芯片捕獲了針對(duì)目標(biāo)肽的第一個(gè)單克隆抗體。然后他將肽溶液流過芯片并測(cè)量RI以檢查親和力。每次實(shí)驗(yàn)后，研究小組都會(huì)簡(jiǎn)單地洗掉單克隆肽復(fù)合物以重復(fù)使用芯片。Pearson說，通過這種方式，每個(gè)芯片通?？梢允褂?00次。