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      基因工程機制可視化
      
			
      
				2019-05-17 10:46:39
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      金澤大學和東京大學的研究人員在Nature Communications上報告了“分子剪刀”動力學的可視化 - 這是CRISPR-Cas9基因工程技術的主要機制。
      

      基因工程機制可視化
      

      基因工程中使用的技術之一 - 人工修飾活生物體基因組的過程 - 涉及所謂的CRISPR-Cas9核酸酶系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)，可以在期望的位點切割細胞的DNA，其中可以刪除或添加基因。通過與Cas9蛋白結合的'指導RNA'分子來選擇待切割的位點?，F(xiàn)在，由金澤大學的Mikihiro Shibata和東京大學的Osamu Nureki領導的研究小組已經(jīng)可視化了CRISPR-Cas9復合物的動態(tài)，特別是它如何切割DNA，為CRISPR-Cas9介導的DNA提供了寶貴的見解。解理機制。
      

      對于他們的可視化研究，科學家們使用高速原子力顯微鏡(HS-AFM)，一種成像表面的方法。通過在其上移動微小的懸臂來探測表面;探頭經(jīng)受的力可以轉換為高度測量值。然后掃描整個表面得到樣品的高度圖。Shibata及其同事的高速實驗設置實現(xiàn)了極快的重復掃描 - 可轉換成參與分子剪切作用的生物分子的電影。
      

      首先，科學家們比較了沒有和附著RNA的Cas9(Cas9-RNA)。他們發(fā)現(xiàn)前者能夠靈活地采用各種構象，而后者具有固定的雙葉結構，突出了指導RNA的構象穩(wěn)定能力。然后，Shibata及其同事研究了穩(wěn)定的Cas9-RNA復合物如何靶向DNA。他們證實它與DNA中預先選擇的原始間隔區(qū)相鄰基序(PAM)位點結合。PAM是位于DNA靶位點旁邊的短核苷酸序列，其與指導RNA互補。
      

      該研究小組的高速電影進一步揭示了靶向('DNA詢問')是通過Cas9-RNA復合物的三維擴散實現(xiàn)的。最后，研究人員設法將切割過程本身的動態(tài)可視化：他們觀察了Cas9-RNA局部解開雙鏈DNA后，“分子剪刀”區(qū)域如何經(jīng)歷構象波動。
      

      Shibata的工作促進了我們對CRISPR-Cas9基因組編輯機制的理解。用研究人員的話來說：“...這項研究提供了關于CRISPR-Cas9功能動力學的前所未有的細節(jié)，并強調(diào)了HS-AFM可能闡明來自不同CRISPR-Cas系統(tǒng)的RNA引導效應核酸酶的作用機制。”
      

      CRISPR-Cas9
      

      CRISPR是“聚集的規(guī)則間隔的短回文重復序列”的縮寫，指的是一組細菌DNA序列，其含有早先攻擊細菌的病毒DNA片段。細菌使用這些片段來防止相同病毒的進一步攻擊。“Cas”指CRISPR相關基因;“Cas9”是具有兩個核酸酶結構域的CRISPR相關蛋白(核酸酶是能夠切割核酸，DNA和RNA中存在的有機分子的酶)。
      

      近年來，開發(fā)了一種基因工程技術，其中CRISPR-Cas9復合物充當“分子剪刀”;Cas9核酸酶與指導RNA分子結合，指導RNA分子包含有關靶位點的DNA位點信息。使用高速原子力顯微鏡，金澤大學的Mikihiro Shibata及其同事現(xiàn)在已經(jīng)非常詳細地研究了CRISPR-Cas9復合物的動力學。
      

      原子力顯微鏡
      

      原子力顯微鏡(AFM)是一種成像技術，其中通過用非常小的尖端掃描表面來形成圖像。尖端的水平掃描運動通過壓電元件控制，而垂直運動轉換成高度輪廓，導致樣品表面的高度分布。由于該技術不涉及透鏡，因此其分辨率不受所謂的衍射極限的限制。在高速設置中，AFM可用于實時生成樣本演變的電影。高速AFM已被成功用于研究蛋白質動力學，例如肌動蛋白V在肌動蛋白絲上行走，光誘導的細菌視紫紅質構象變化和纖維素降解。
      
			

			
        
      
			
      
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