研究人員首次使用病毒載體處理遺傳疾病的動物模型，以提供基因組編輯組件，其中已經(jīng)糾正了導(dǎo)致疾病的突變。根據(jù)賓夕法尼亞大學(xué)佩雷??爾曼醫(yī)學(xué)院的研究人員的一項新研究，該載體向新生小鼠的傳遞提高了它們的存活率，同時成年動物的治療意外地使它們變得更糟。該小組于本周在Nature Biotechnology上發(fā)表了他們的研究結(jié)果。。

“在這種動物模型中糾正出生后引起疾病的突變使我們向?qū)崿F(xiàn)個性化醫(yī)療的潛力邁進了一步，”資深作者，醫(yī)學(xué)博士，醫(yī)學(xué)教授，賓夕法尼亞州孤兒疾病中心主任詹姆斯威爾遜說。 。“盡管如此，我35年的基因治療生涯告訴我，將小鼠研究轉(zhuǎn)化為成功的人類治療是多么困難。從這項研究中，我們現(xiàn)在正在調(diào)查基因編輯系統(tǒng)，以便在我們調(diào)查的下一階段解決不可預(yù)見的問題。成年動物的并發(fā)癥。“ 威爾遜也是賓夕法尼亞基因療法計劃的主任。

威爾遜實驗室將肝臟作為基因編輯的目標，因為他們在使用基于腺相關(guān)病毒(AAV)的載體的傳統(tǒng)基因療法的先前工作中解決了該器官中基因遞送的問題。然而，AAV的基因替代療法對于治療表現(xiàn)為新生兒的肝臟遺傳疾病并不理想，因為隨著發(fā)育中的肝細胞增殖，非整合基因組丟失。

因為威爾遜，共同第一作者，病理學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)研究副教授，合作者Lili Wang博士認為新生兒肝臟可能是使用CRISPR-Cas9(一種RNA)進行AAV介導(dǎo)的基因校正的理想器官。引導(dǎo)基因組編輯技術(shù)，使用細菌蛋白Cas9。使用CRISPR-Cas9時，校正的突變將在載體基因組丟失時持續(xù)存在。

該假設(shè)在由稱為鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)的酶缺乏引起的罕見代謝性尿素循環(huán)障礙的小鼠模型中進行了測試。尿素循環(huán)是一系列六種肝酶，有助于排除體內(nèi)氨，蛋白質(zhì)代謝的分解產(chǎn)物。當(dāng)其中一種酶缺失或缺乏時，氨會在血液中積聚并傳播到大腦，從而導(dǎo)致許多問題，包括腦損傷和死亡。

OTC缺乏是尿素循環(huán)障礙中最常見的，每40,000例中就有一例出現(xiàn)。突變的OTC基因可導(dǎo)致比正常短，形狀錯誤或根本不產(chǎn)生的酶。負責(zé)OTC的基因突變發(fā)生在X染色體上，因此女性通常是攜帶者，而具有突變基因的兒子患有該疾病。

剪切和粘貼

研究小組注射了兩種AAV(特別是在Wilson實驗室中發(fā)現(xiàn)的對肝細胞具有親和力的AAV8血清型)，一種表達Cas9，另一種表達指導(dǎo)RNA和供體DNA，進入具有OTC缺乏的新生小鼠。

一只AAV通過肝特異性啟動子運送Cas9酶，以確保其僅在注射到血液中時在肝細胞中表達。雙系統(tǒng)中的另一個AAV運送了一個指導(dǎo)RNA - 一個20堿基的遺傳構(gòu)建塊，然后是另一個序列，將Cas9酶引導(dǎo)到肝細胞核內(nèi)DNA的正確位置。第二個AAV還含有供體DNA模板以校正突變，從而可以由細胞制備正常的OTC蛋白。添加這種供體DNA以實際校正突變使該研究與其他最近的基因組編輯研究結(jié)果區(qū)別開來，這些研究結(jié)果通過刪除正?；虻囊徊糠謥硪?guī)避突變。

整個校正系統(tǒng)基本上是一個“剪切和粘貼”功能，“粘貼”階段的最后一部分依賴于細胞自身的DNA修復(fù)機制，將OTC基因再次正確地重新連接在一起。

在新生小鼠中，通過肝細胞中OTC酶的存在測量，AAV系統(tǒng)的注射平均恢復(fù)了10%肝細胞中的突變。他們還看到在高蛋白飲食挑戰(zhàn)的幼鼠中存活率增加，這使得老鼠的OTC缺陷癥狀更加嚴重。

相比之下，超過30%的未經(jīng)治療的OTC缺陷小鼠在一周后死亡，其氨水平顯著高于其基因得到糾正的OTC小鼠。在處理的小鼠中從肝細胞分離的DNA的深度測序也顯示對突變的校正與存活結(jié)果一致。

另一方面，使用相同的雙AAV系統(tǒng)，成年，8至10周齡的OTC缺陷小鼠的基因校正較低。成年人還表現(xiàn)出正常飼料中蛋白質(zhì)耐受性降低和致死性高氨血癥。三周后，低劑量基因校正的成年小鼠開始死亡，并且違反直覺，給予高劑量的小鼠在注射后9天開始死亡。

“我們對這些結(jié)果感到驚訝，但經(jīng)過一些進一步的調(diào)查，我們破譯了基因編輯使成年動物的狀況惡化的機制，”王說。觀察成年小鼠肝細胞中的DNA序列，他們發(fā)現(xiàn)具有校正糊狀功能的細胞頻率僅為1%左右。“這肯定不足以幫助這些成年老鼠，”王說。更有問題，更完全出乎意料的是，許多未校正的基因含有大的缺失，消除了突變OTC基因的殘留活性。

糾正基因的第一步是在靠近突變(Cut)的位置通過Cas9產(chǎn)生DNA中斷，在供體DNA存在下，該突變在所謂的同源性中設(shè)定了突變的校正階段。定向修復(fù)(HDR或粘貼)。“看來HDR在新生肝細胞中比在成人肝細胞中更有效。” 威爾遜說。

在沒有HDR的情況下，細胞將使用另一種稱為非同源末端連接(NHEJ)的過程修復(fù)切割，該過程在其尾跡中留下小的插入或缺失。該團隊將切割指向OTC基因的一部分，如果被小插入或缺失擾亂，則不會干擾突變OTC基因的殘留功能。這是新生小鼠的情況。

然而，該團隊了解到，成人肝細胞中的NHEJ導(dǎo)致更大的缺失，其中一些消除了OTC基因的任何殘余功能。對于在許多細胞中破壞剩余基因功能的針對Cut的低速率的低結(jié)果的最終結(jié)果導(dǎo)致對成年小鼠中蛋白質(zhì)的較低耐受性。

“ 在成年OTC小鼠中觀察到的基因編輯的后果僅限于治療突變減少但不能消除功能的遺傳性疾病，”Wilson解釋說。為了在某??些患有肝病的成年患者中避免這個問題，該團隊正在探索創(chuàng)建切割的方法，同時不會引起大的刪除，同時驅(qū)動更高頻率的粘貼。