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      新的SLENDR技術 通過基因組編輯在發(fā)育中的大腦中進行蛋白質(zhì)標記
      
			
      
				2019-01-22 11:33:36
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      Ryohei Yasuda博士及其團隊開發(fā)了一種名為SLENDR的方法，可以精確修飾活體樣本中的神經(jīng)元DNA。利用他們的新技術，研究團隊能夠在同一細胞中可靠地同時標記兩種不同顏色的不同蛋白質(zhì)。研究人員使用各種成像方法以及DNA測序來確認SLENDR方法真正準確地敲除了基因。
      

      新的SLENDR技術 通過基因組編輯在發(fā)育中的大腦中進行蛋白質(zhì)標記
      

      Ryohei Yasuda，Ph.D。他在馬克斯普朗克佛羅里達神經(jīng)科學研究所(MPFI)的團隊正在努力了解我們學習和形成記憶時大腦細胞的變化方式。但由于缺乏允許科學家在單個神經(jīng)元內(nèi)定位和可視化單個蛋白質(zhì)的技術，該領域的研究受到限制。目前的成像方法不能提供足夠強的特異性，對比度和分辨率來觀察不同的蛋白質(zhì)。此外，它們耗時且昂貴; 開發(fā)工程模型可能需要一到兩年的時間。但是當研究員Jun Nishiyama，醫(yī)學博士和博士后研究員，以及Takayasu Mikuni，醫(yī)學博士，博士，閱讀關于CRISPR / Cas9，一種突破性的DNA編輯技術，在2014年開發(fā)，他們有一個理念。
      

      CRISPR是一種內(nèi)置于細菌DNA中的工具，單細胞生物用它來對抗感染。當病毒侵入并試圖將其感染性DNA插入細菌細胞時，細菌DNA的一個特殊區(qū)域(稱為CRISPR)會切割病毒DNA并使其無法造成嚴重破壞?？茖W家們已經(jīng)開始使用CRISPR / Cas9來破壞除細菌以外的細胞和生物中的特定基因。當這種損害發(fā)生時，細胞用兩種方法修復其DNA。一種是同源定向修復(HDR)，另一種是非同源末端連接(NHEJ)。HDR更加精確，可以重建或替換受損基因，而NHEJ可以降解受損基因并重新附著剩下的末端，通常會刪除受損基因的表達，但不會替換它。
      

      如果細胞使用HDR進行自我修復，科學家可以在CRISPR系統(tǒng)中包含一個所需的基因，該基因?qū)⒉迦隓NA中以替換受損基因。許多研究人員認為，一旦細胞停止分裂，它通常使用NHEJ而不是HDR來修復任何破碎的DNA。盡管CRISPR系統(tǒng)具有令人印象深刻的能力，但在腦細胞中操縱DNA幾乎沒有成功，因為在大腦形成的時候，它的細胞不再分裂。雖然科學家可以相對容易地使用CRISPR來敲除大腦中的某些基因，但細胞分裂的缺乏使他們很難通過HDR以可靠的精確度敲入所需的基因。
      

      Yasuda和他的團隊開發(fā)了一種方法，他們稱之為SLENDR(通過CRISPRCas9介導的同源定向修復對內(nèi)源蛋白進行單細胞標記)，可用于精確修飾活體樣本中的神經(jīng)元DNA。在實驗模型中，該團隊用于子宮內(nèi)電穿孔，這種技術允許他們將CRISPR / Cas9系統(tǒng)插入仍在發(fā)育和分裂的產(chǎn)前腦細胞中。因此，破碎的DNA仍然通過HDR進行修復，使研究人員能夠在顯微鏡下添加一種可以使目的蛋白質(zhì)可見的基因。他們甚至能夠在同一細胞中同時可靠地標記兩種不同顏色的不同蛋白質(zhì)。研究人員使用各種成像方法以及DNA測序來確認SLENDR方法真正準確地敲除了基因。在測試新技術的同時，研究小組觀察到蛋白激酶C的α同種型之前未被描述的行為。在發(fā)育早期，出生后約7天，發(fā)現(xiàn)它聚集在細胞膜上，表明它是高度活躍的，而在出生后一個月，它在整個細胞中彌漫性擴散，表明它在發(fā)育后期不會保持高度活躍。
      

      “我相信SLENDR將成為分子和細胞神經(jīng)生物學的標準工具，”Yasuda說。“SLENDR為確定蛋白質(zhì)的亞細胞定位提供了有價值的手段，并將幫助研究人員確定蛋白質(zhì)的功能。”
      
			

			
        
      
			
      
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