光不能用于對(duì)小于其波長一半的任何結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像 - 長期以來，這被認(rèn)為是光學(xué)顯微鏡中的最終分辨率極限。然而，超分辨率顯微鏡的發(fā)展表明，這一規(guī)則存在一定的漏洞。通過在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行成像，它們的確切位置最終可以組合成一個(gè)清晰的圖像。2014年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了這一理念。從那時(shí)起，超分辨率顯微鏡技術(shù)，如STORM和PALM，已成為研究細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)組織的常用方法。

令人驚訝的是，許多研究小組發(fā)現(xiàn)，幾乎所有研究的蛋白質(zhì)都在細(xì)胞膜中形成簇。在他們研究這些蛋白質(zhì)簇的過程中，TU Wien的研究人員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的發(fā)現(xiàn)。通常，所謂的簇實(shí)際上是單個(gè)閃爍的分子，其被計(jì)數(shù)多次。團(tuán)隊(duì)現(xiàn)在在“ 自然方法 ”雜志上提出的一種新方法可以將真實(shí)的星團(tuán)與這些人工制品區(qū)分開來。

細(xì)胞生物學(xué)的現(xiàn)代成像

“對(duì)于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的許多重要問題，理解細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要”，來自TU Wien的GerhardSchütz教授領(lǐng)導(dǎo)的生物物理研究小組的Florian Baumgart說。“超分辨率顯微鏡是研究細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)空間排列的理想工具。我們的研究重點(diǎn)是T細(xì)胞，它可以識(shí)別抗原，因此在我們的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。”

為了將超分辨率顯微鏡應(yīng)用于生物樣品，蛋白質(zhì)用熒光分子(所謂的熒光團(tuán))標(biāo)記。在經(jīng)典熒光顯微鏡中，單個(gè)熒光團(tuán)不是透明點(diǎn)，而是褪色圓。因此，如果所有這些分子同時(shí)亮起，則它們的圖像重疊并且關(guān)于其精確空間排列的信息丟失。使用化學(xué)技巧或特殊照明方案，可以使熒光團(tuán)在不同時(shí)間點(diǎn)點(diǎn)亮。拍攝一系列照片，每個(gè)照片上只能看到幾個(gè)分離良好的熒光團(tuán)。隨后，計(jì)算機(jī)程序確定每個(gè)圖像上分子的確切位置。這最終允許從所有確定的單分子位置重建一個(gè)高分辨率圖像。

神秘的集群

“近年來，各種研究小組已經(jīng)研究了蛋白質(zhì)如何在細(xì)胞膜上分布。他們一次又一次地發(fā)現(xiàn)，幾乎所有蛋白質(zhì)都形成簇，而不是假設(shè)隨機(jī)位置”，F(xiàn)lorian Baumgart說。

乍一看，這似乎是合理的。眾所周知，在抗原識(shí)別過程中，T細(xì)胞可以產(chǎn)生穩(wěn)定的蛋白質(zhì)簇，即使用經(jīng)典的熒光顯微鏡也可以觀察到足夠大的蛋白質(zhì)簇。微小的納米級(jí)蛋白質(zhì)簇被認(rèn)為是這些較大結(jié)構(gòu)的前體 - 對(duì)T細(xì)胞的功能非常重要。

Florian Baumgart也一直在尋找這些納米團(tuán)簇。但超分辨率顯微鏡是一個(gè)復(fù)雜的問題，有許多可能的誤差來源。必須仔細(xì)評(píng)估數(shù)據(jù)以獲得可靠的結(jié)果。有時(shí)分子可以多次點(diǎn)亮，這很容易被誤認(rèn)為是分子簇。

弗洛里安鮑姆加特說：“我們考慮過如何區(qū)分交替發(fā)光的分子簇和一個(gè)反復(fù)閃爍的單個(gè)分子”。決定性的想法是改變熒光團(tuán)的濃度。“在圖片中，聚類和單個(gè)閃爍分子可能難以區(qū)分，但當(dāng)我們?cè)黾訜晒鈭F(tuán)濃度時(shí)，分布的統(tǒng)計(jì)特性是不同的。” 如果標(biāo)記的分子確實(shí)形成簇，則當(dāng)使用增加量的熒光標(biāo)記時(shí)，越來越多的分子位置變得可見。但是在群集之間，仍然存在黑暗空間。另一方面，如果它是隨機(jī)分布的分子點(diǎn)亮幾次，熒光分子數(shù)量越來越多 最終將覆蓋整個(gè)表面，而不會(huì)在任何特定區(qū)域形成簇。

“我們發(fā)現(xiàn)我們感興趣的膜蛋白根本不會(huì)形成簇 - 這個(gè)理論必須被拋棄”，F(xiàn)lorian Baumgart說。“然而，確實(shí)存在確實(shí)形成聚類的蛋白質(zhì)的例子。我們可以證明這些蛋白質(zhì)的圖片具有完全不同的統(tǒng)計(jì)特性。”這種區(qū)分簇與閃爍分子的方法現(xiàn)已發(fā)表在“自然方法”雜志上。它有望幫助解釋超分辨率數(shù)據(jù)，并可能成為幫助理解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)組織的重要工具。