與使用CRISPR-Cas進(jìn)行基因組編輯一樣強(qiáng)大，該技術(shù)存在局限性。其中之一就是確定單個(gè)CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因型的能力?，F(xiàn)在，來(lái)自馬克斯·普朗克佛羅里達(dá)神經(jīng)科學(xué)研究所(MPFI)的一個(gè)研究小組開(kāi)發(fā)了一種在CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元中進(jìn)行單細(xì)胞基因分型的策略，并表明它們可以識(shí)別體內(nèi)表型的遺傳原因。

這項(xiàng)工作發(fā)表在“ 細(xì)胞報(bào)告 ”中的“ 用CRISPR / Cas9轉(zhuǎn)染的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的體內(nèi)單細(xì)胞基因分型 ”中。

“基于CRISPR / Cas9的基因靶向技術(shù)有望系統(tǒng)地理解神經(jīng)回路的組裝，功能和功能障礙的分子基礎(chǔ)，”抑制性神經(jīng)發(fā)育與功能研究組組長(zhǎng)Hiroki Taniguchi博士指出。 MPFI的電路組。“通過(guò)我們的單細(xì)胞測(cè)序確定的基因型與通過(guò)表型評(píng)估推導(dǎo)的基因型之間的完美匹配，表明我們的方法是一種強(qiáng)大的新方法，能夠增強(qiáng)可靠性并擴(kuò)展基于CRISPR的技術(shù)的應(yīng)用。”

作者解釋說(shuō)，非同源末端連接(NHEJ)“隨機(jī)產(chǎn)生不同類(lèi)型的突變，如缺失，取代和插入，這可能導(dǎo)致基因突變，功能喪失和功能獲得等位基因。”最重要的是，CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的突變可能以單等位基因或雙等位基因的方式發(fā)生。

“由于NHEJ，盡管CRISPR可以精確地靶向目標(biāo)基因，但其作用可能高度可變，” MPFI研究員，該出版物的第一作者Andre Steinecke博士解釋說(shuō)。“ CRISPR可以使細(xì)胞帶有完全無(wú)功能的基因，弱化的基因，甚至有時(shí)甚至增強(qiáng)其功能。” Steinecke斷言：“當(dāng)去除對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯影響的細(xì)胞時(shí)，這并不是問(wèn)題，因?yàn)槟梢暂p松地觀察到變化并且缺少該基因編碼的蛋白質(zhì)。但是有些，尤其是大腦中的基因，沒(méi)有明顯的作用或很難想象。”

該小組的目標(biāo)是創(chuàng)建一種廣泛應(yīng)用的策略，能夠可靠地確定確切的遺傳原因并將其與觀察到的表型相關(guān)聯(lián)。為此，他們將激光顯微切割技術(shù)與單細(xì)胞基因分型相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)管線(xiàn)，能夠研究CRISPR介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)，同時(shí)準(zhǔn)確確定引起它們的確切DNA變化。

研究人員表明，皮層切片的切片和隨后的激光顯微切割使它們能夠分離出單個(gè)CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元。在單個(gè)參考神經(jīng)元中包含CRISPR-Cas靶向基因組區(qū)域的PCR產(chǎn)物的測(cè)序提供了與從其靶蛋白表達(dá)和表型推導(dǎo)的基因型完全一致的基因型，從而建立了一種強(qiáng)有力的策略來(lái)確定CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元的基因型和表型之間的因果關(guān)系。

為了驗(yàn)證他們的策略，MPFI的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了CRISPR技術(shù)，將金字塔神經(jīng)元中的一種基因編碼為關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，稱(chēng)為Ankyrin-G(AnkG)。通常，AnkG蛋白被限制在神經(jīng)元的特定區(qū)域，即軸突初始節(jié)(AIS)，負(fù)責(zé)產(chǎn)生動(dòng)作電位。去除AnkG后，AIS會(huì)發(fā)生明顯的增厚，可以使用顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。有了這個(gè)特征，可以容易地區(qū)分出缺少AnkG的神經(jīng)元，然后可以確定它們的確切基因型。他們發(fā)現(xiàn)，以CRISPR探針轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元主要表現(xiàn)出AnkG缺失以及AIS明顯增厚。但是一小部分被CRISPR轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元仍然表現(xiàn)出與野生型神經(jīng)元相當(dāng)?shù)腁nkG水平和AIS厚度。證明了CRISPR對(duì)不同細(xì)胞的不同作用。

為了探測(cè)和確認(rèn)潛在的遺傳原因，研究小組隨后使用激光顯微解剖法分離并提取了已經(jīng)表征了表型的單個(gè)神經(jīng)元。提取后，研究小組分別對(duì)每個(gè)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，以確定基因型。他們發(fā)現(xiàn)他們的策略可以可靠且可重復(fù)地將觀察到的表型與基因型聯(lián)系起來(lái)，其中缺乏AnkG且軸突增厚的神經(jīng)元在該基因的兩個(gè)拷貝中均顯示功能喪失突變，而AnkG正常水平的神經(jīng)元?jiǎng)t僅在一個(gè)拷貝中顯示突變( CRISPR或正常基因型(對(duì)照神經(jīng)元)轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元。然后，研究小組使用另外兩個(gè)基因MeCP2和Satb2確認(rèn)了他們的策略，發(fā)現(xiàn)他們的過(guò)程可以再次有效地將觀察到的特征與潛在遺傳相關(guān)。