科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出一種方法來提高Duchenne肌營養(yǎng)不良癥(DMD)中CRISPR基因編輯的效率，這項研究可能對優(yōu)化其他疾病的基因療法產(chǎn)生影響。該發(fā)現(xiàn)源于UT西南大學(xué)的研究，其中在小鼠和人類細(xì)胞上使用單切基因編輯技術(shù)來糾正DMD的常見突變，DMD是肌營養(yǎng)不良蛋白(一種對肌肉功能至關(guān)重要的蛋白質(zhì))喪失引起的致命疾病。

在測試該技術(shù)的同時，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)調(diào)整CRISPR基因編輯組分的劑量可以顯著改善編輯基因產(chǎn)生的肌營養(yǎng)不良蛋白的數(shù)量。他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，組分的最佳比例根據(jù)編輯的DNA部分而變化。

“由于我們測試的抗肌萎縮蛋白基因的其他缺陷的部件CRISPR，這可能是重要的調(diào)整我們的公式以獲得最佳效果，”埃里克·奧爾森博士，誰領(lǐng)導(dǎo)發(fā)表的研究報告說科學(xué)進(jìn)展。“這種新的見解進(jìn)一步促進(jìn)了CRISPR作為Duchenne療法的應(yīng)用，也許還有許多其他疾病。”

意想不到的發(fā)現(xiàn)

研究人員使用的基因編輯技術(shù)需要兩種成分 - 一種稱為Cas9的酶，可切割DNA，一種指導(dǎo)RNA，其作用類似于分子GPS裝置，可將Cas9導(dǎo)入待編輯基因組中的特定DNA序列。

Olson博士的實驗室開發(fā)了一種編輯肌營養(yǎng)不良蛋白基因缺陷部分的方法，將Cas9加載到腺相關(guān)病毒(AAV)中，這是一種無害的病毒，用于將編輯成分傳遞到細(xì)胞中。還將指導(dǎo)RNA加載到AAV中以將Cas9引導(dǎo)至其突破DNA的突變。

編輯過程繞過突變并使肌纖維產(chǎn)生肌營養(yǎng)不良蛋白，Olson博士在大型哺乳動物，小鼠和人類細(xì)胞的先前研究中記錄了陽性結(jié)果。

在這些研究中，研究小組使用標(biāo)準(zhǔn)的1比1的Cas9和指導(dǎo)RNA來幫助恢復(fù)肌肉中的肌營養(yǎng)不良蛋白產(chǎn)生至正常值的90%以上。

在針對該基因不同部分的新研究中，他們發(fā)現(xiàn)1比1的比例不起作用：當(dāng)輸送到血流中時，抗肌萎縮蛋白的產(chǎn)生僅恢復(fù)到正常值的5%。

通過反復(fù)試驗，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)使用10比1的指導(dǎo)RNA與Cas9的比例可以對肌營養(yǎng)不良蛋白基因的特定片段進(jìn)行最佳編輯。在CRISPR劑量的四周內(nèi)，在具有共同DMD突變的小鼠中約90%的肌肉和心臟纖維中肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生得以恢復(fù)。

“這很令人驚訝，”該研究的第一作者Yi-Li Min博士說。“我們總是使用等量的兩種病毒來提供指導(dǎo)RNA和Cas9，并沒有考慮改變比例。”

有缺陷的外顯子

DMD是男孩中最常見的致命遺傳疾病，導(dǎo)致肌肉和心臟衰竭，并在30年代早期導(dǎo)致過早死亡。隨著肌肉退化，患者被迫坐輪椅，最終因為膈肌減弱而進(jìn)入呼吸器。盡管科學(xué)家們已經(jīng)知道，構(gòu)成長肌營養(yǎng)不良蛋白基因的79個外顯子中的任何一個缺陷都會導(dǎo)致這種情況，但是沒有有效的治療方法存在。

Olson博士發(fā)表了多項研究，他的實驗室在DNA的戰(zhàn)略要點進(jìn)行單一切割，以糾正突變。包括他最新研究的重點是刪除外顯子44，他的實驗室已經(jīng)創(chuàng)建了針對DMD患者中五種最常見缺陷的CRISPR技術(shù)，占全球約一半的病例。外顯子44的臨床治療位于該基因最常見的突變熱點之一，可能使約12%的患者受益。

這些技術(shù)尚未被批準(zhǔn)用于臨床用途，但是Olson博士的團(tuán)隊在去年發(fā)表科學(xué)研究表明外顯子51上的CRISPR編輯阻止了狗的DMD進(jìn)展后，朝著這個目標(biāo)邁出了重要的一步。

在基因編輯的幾周內(nèi)，缺失的蛋白質(zhì)在整個身體的肌肉組織中恢復(fù)，包括92%的心臟矯正和58%的膈肌，即呼吸所需的主要肌肉。科學(xué)家估計需要15%的閾值才能顯著幫助患者。

該實驗室正在對狗進(jìn)行長期研究，以測量肌營養(yǎng)不良蛋白水平是否保持穩(wěn)定，并確?；蚓庉嫑]有不良副作用。

Olson博士希望下一步超越狗只是一項臨床試驗，這將是UT西南大學(xué)基因治療計劃旨在在未來幾年內(nèi)推出以應(yīng)對眾多致命的兒童疾病的幾項試驗。

“我們在臨床上使用之前還有更多工作要做，”奧爾森博士說，“但看到我們走了多遠(yuǎn)，我們感到非常興奮。”