在CRISPR基因組編輯中 Cpf1證明了其顯著的特異性并產(chǎn)生了突變小鼠

作為CRISPR基因組編輯的新工具，Cpf1因其與Cas9不同的屬性引起了人們的興趣：它只需要一個RNA，即CRISPR RNA組裝更簡單; 其交錯的切割模式可以促進用所需的序列取代現(xiàn)有的DNA; 它識別富含胸苷的DNA序列，與Cas9識別的富含鳥苷的序列相比，它的研究較少?？傊珻pf1有望擴大CRISPR基因組編輯目標位點的范圍，提高效率。盡管Cpf1作為一種強大的基因組編輯工具具有巨大的潛力，但很少有人證明新工具如何找到其目標。在6月6日在線發(fā)表在Nature Biotechnology上的一系列論文中，韓國IBS基因組編輯中心的研究人員將Cpf1作為一種高度特異性的可編程工具，適用于精確基因組編輯，并報告使用CRISPR-Cpf1生成突變小鼠。

研究人員使用了兩種類型的Cpf1家族蛋白(AsCpf1和LbCpf)，因為它們是同類中最有效的，并進行了Digenome-seq：他們設計的一項測試，用于識別預期(目標)和非預期(脫靶)位點。研究人員希望Cpf1在整個基因組中進行切割。從預先組裝的重組Cpf1 RNP切割從人細胞分離的無細胞基因組DNA，并進行全基因組測序。通過計算鑒定對應于靶標和脫靶體外切割位點的序列讀數(shù)的均一比對。

全基因組分析表明，與Cas9相比，Cpf1具有高度特異性，顯示出較少的脫靶切割位點(LbCpf1為6，AsCpf1為12)，在人類基因組中> 90個位點切割(圖1a)。具體而言，在大多數(shù)體外切割位點，indel(代表脫靶效應)低于0.1%，遠低于相應的靶標位點，表明兩種Cpf1蛋白幾乎沒有脫靶效應。“值得注意的是，針對特定位點的LbCpf1和AsCpf1僅切割整個人類基因組中的靶標位點”，該研究的第一作者之一KIM Daesik說(圖1b)。

“為了減少脫靶效應，我們將預裝配的Cpf1 RNP引入細胞，假設Cpf1 RNP與Cas9 RNP類似，在轉染后立即切割靶位點，并會被破壞蛋白質的內(nèi)源酶快速降解，從而減少 - 在不犧牲目標效應的情況下實現(xiàn)目標效果。“ KIM Jin-Soo說，兩篇論文的通訊作者和IBS中心主任。實際上，Cpf1 RNPs沒有誘導任何足夠高的插入缺失以在非靶位點產(chǎn)生突變(圖2)。

顯示Cpf1顯著的特異性，來自同一IBS中心的另一個研究小組成功地將Cpf1 RNP介導的突變引入小鼠胚胎：研究人員針對Foxn1(調節(jié)免疫系統(tǒng)的轉錄因子，包括皮膚毛發(fā)的生長)，以及酪氨酸酶(一種催化黑色素生成的酶，黑色素是一種決定皮膚顏色的天然色素)。該研究的第一作者HUR K Junho說：“數(shù)據(jù)顯示Cpf1 RNP向小鼠胚胎的分娩導致了高突變頻率的預期遺傳功能，分別為64%和33%。我們將突變小鼠胚胎移植到替代品中母親和獲得有針對性突變的小鼠。突變分別導致無毛和白發(fā)小鼠(圖3a)。赫爾補充道，“ 為了研究Cpf1是否具有脫靶效應，我們使用從一個Foxn1突變小鼠及其野生型同胞中分離的基因組DNA進行全基因組測序。序列分析顯示沒有發(fā)生脫靶突變。其他突變體的靶向深度測序也顯示沒有脫靶突變“

在這項研究中，研究人員使用電脈沖將Cpf1 RNP 同時滲透到多達50個小鼠胚胎中(圖3b)。這種新的電穿孔提供了用于產(chǎn)生突變動物的基因組編輯分子。與常規(guī)顯微注射相比，電穿孔方法易于實施，快速且可擴展。

將Cpf1添加到其工具箱中，CRISPR編輯技術可以構建更多樣化的鼠標模型。IBS基因組編輯中心主任兼兩位研究的相應作者KIM Jin-soo評論說：“由于這兩項研究證明了Cpf1的優(yōu)越特異性，這種新的核酸酶將被更廣泛地用于精確的基因組編輯，而不是CRISPR Cpf1的應用不會受到限制，但仍然保持開放，從治療性治療開始，如無毒性癌癥藥物，干細胞治療，高附加值牲畜和農(nóng)產(chǎn)品。“

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