蘭特生物學(xué)家羅杰·英尼斯和他的團(tuán)隊(duì)在美國印第安納大學(xué)布盧明頓希望了解植物細(xì)胞是怎么死的。在2012年秋天，他們用細(xì)菌病原體感染了模式生物擬南芥的葉子。然后他們切下感染葉片的薄片，并將切片放在電子顯微鏡下。當(dāng)他們在細(xì)胞壁和內(nèi)部質(zhì)膜之間的空間中反復(fù)看到一束圓形結(jié)構(gòu)時(shí)，研究人員感到驚訝。Innes不熟悉微小的斑點(diǎn)，向同事們展示了圖像，他們指出了他的老研究，有些可以追溯到20世紀(jì)60年代，這些研究在其他植物中描述了類似的東西：一組稱為囊泡的小的膜包裹的球體，被稱為更大的膜多泡體(MVB)。

在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)水泡并不是那么罕見; 植物和動(dòng)物細(xì)胞使用囊泡進(jìn)行各種各樣的事情，例如在細(xì)胞周圍運(yùn)送分子或從細(xì)胞膜中回收蛋白質(zhì)。但是Innes和其他人已經(jīng)將這些MVB捕獲到與質(zhì)膜融合并釋放他們的貨物 - 那些較小的膜結(jié)合囊泡 - 進(jìn)入細(xì)胞膜與其壁之間的空間。這張照片與哺乳動(dòng)物細(xì)胞和真菌細(xì)胞排出一種稱為外泌體的特定類型囊泡的方式非常相似，該外泌體從MVB內(nèi)部開始，其他外泌體在MVB與質(zhì)膜融合時(shí)自由釋放。

外來體在1983年首次在未成熟的大鼠血細(xì)胞中被描述，并且他們的發(fā)現(xiàn)隨后迅速引起了研究興趣的爆發(fā)。在哺乳動(dòng)物中，外泌體在細(xì)胞 - 細(xì)胞通訊，免疫反應(yīng)和惡性腫瘤等中起重要作用。它們的內(nèi)容也可以反映其起源細(xì)胞的狀態(tài)，近年來，這些細(xì)胞使得囊泡成為研究創(chuàng)傷性腦損傷和癌癥等疾病的生物標(biāo)志物的焦點(diǎn)。盡管外泌體在哺乳動(dòng)物中的重要性越來越受到重視，但除了舊的顯微鏡圖像之外，對植物中的外泌體一無所知，這表明它們的存在。“在這些報(bào)紙上幾乎沒有對它們發(fā)表評論，”英納斯回憶道。

他看到了健康和垂死細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)，所以他們似乎沒有在細(xì)胞死亡中起作用，這是他最初開始研究的現(xiàn)象。但是Innes對他懷疑是外泌體的東西很感興趣，并且他要求研究生Brian Rutter找到一種方法從擬南芥葉片的細(xì)胞外空間中純化結(jié)構(gòu)?？梢詮募?xì)胞培養(yǎng)液，血液，尿液和任何數(shù)量的其他體液中收集來自人或動(dòng)物細(xì)胞的外來體。植物中類似的液體并不那么容易收集 - 這可能是其中一個(gè)原因，Innes說，因?yàn)槿狈χ参锿饷隗w的研究。“無法凈化他們，你無法真正說出他們的角色是什么，”他說。

截至2014年底，Rutter和Innes已經(jīng)開發(fā)出一種工作方案，使他們能夠首次描述純化植物外泌體的含量。2從那時(shí)起，英尼斯的組和其他擁有先進(jìn)的這些囊泡突飛猛進(jìn)的理解。例如，囊泡可以解釋植物如何發(fā)出防御性蛋白質(zhì)和RNA來保護(hù)自己免受病原體侵害，它們可能會成為未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的寶庫，加州大學(xué)河濱分校的植物科學(xué)家Hailing Jin說。。“以前[植物生物學(xué)家]無法回答有很多未解決的問題，”她說，“現(xiàn)在他們覺得外泌體可以提供非常好的解釋。”

包括Innes和Jin在內(nèi)的研究人員剛剛開始研究植物外泌體的表面。一些科學(xué)家也開始將其潛力視為農(nóng)業(yè)乃至醫(yī)學(xué)的有用工具。

證實(shí)了外泌體釋放理論

當(dāng)Innes和他的團(tuán)隊(duì)開始研究外泌體時(shí)，囊泡存在的證據(jù)已經(jīng)建立多年。除了具有50年歷史的電子顯微照片之外，最早的線索之一來自2003年描述擬南芥的報(bào)告。植物抵抗一種白粉病侵襲所需的基因。由于被稱為haustoria的真菌飼養(yǎng)結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞壁并壓靠質(zhì)膜，植物細(xì)胞沉積材料以加強(qiáng)裂口附近的細(xì)胞壁并防止真菌破壞質(zhì)膜。對這種防御措施至關(guān)重要的兩種蛋白質(zhì)，稱為PEN1和ROR2，被證明是一種名為SNARE的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的同源物。SNARE在哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)，在膜融合和外泌體釋放中發(fā)揮作用。3

目前尚不清楚外泌體形成和釋放PEN1和ROR2的哪些步驟起作用，但它們與SNARE的同源性是膜融合以某種方式參與保護(hù)植物免受真菌滲透的第一個(gè)暗示，Mads Nielsen說，他是植物和土壤科學(xué)家。哥本哈根大學(xué)。當(dāng)兩個(gè)不同膜上的SNARE蛋白質(zhì)相互鎖定時(shí)，它們將相對的膜帶到一起并使它們?nèi)诤?。?dāng)這種融合發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)囊泡和細(xì)胞的質(zhì)膜之間時(shí)，囊泡的內(nèi)容物從細(xì)胞中釋放出來，這與MVB用于釋放外泌體的過程相同。

植物釋放外泌體的一個(gè)更誘人的暗示出現(xiàn)在2009年，當(dāng)時(shí)研究人員對擬南芥植物進(jìn)行了基因工程改造，使得PEN1在某些波長的光線下發(fā)出綠光。在細(xì)胞外，綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽通常由于pH的變化而停止發(fā)光。但是一些研究小組注意到PEN1甚至在空間中仍然發(fā)出熒光，稱為質(zhì)外體，在植物細(xì)胞質(zhì)膜外，表明蛋白質(zhì)在某種程度上受到保護(hù)。4 “我們都種在同一時(shí)間，只有這樣，我們可以看到這種現(xiàn)象出現(xiàn)的將是由外來體的分泌推測，”尼爾森說。

當(dāng)Innes和Rutter正在尋找一種方法來驗(yàn)證其分離外泌體的技術(shù)時(shí)，PEN1是一個(gè)完美的標(biāo)記。他們最初觀察到的蛋白質(zhì)和囊泡都在真菌吸器周圍大量出現(xiàn)，植物傾倒細(xì)胞壁材料和蛋白質(zhì)以保護(hù)自身。“我們認(rèn)為這種蛋白質(zhì)是否在那里積聚，這些囊泡在那里積聚，然后蛋白質(zhì)可能在囊泡中，”Innes說。

Rutter設(shè)計(jì)了一種通過離心從擬南芥葉中提取質(zhì)外體液的方法，然后根據(jù)其密度分離組分。在質(zhì)外體含量中，他發(fā)現(xiàn)含有PEN1的囊泡直徑在50到200nm之間，類似于哺乳動(dòng)物外泌體，其范圍從30到150.囊泡還含有通常在MVB中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，已知它們在動(dòng)物中宿主外來體。 。他說，這一調(diào)查線已經(jīng)引領(lǐng)他的實(shí)驗(yàn)室走向了許多新的方向，因?yàn)樵撔〗M焦急地試圖找出這些推定的外泌體內(nèi)部究竟是什么以及它們對植物細(xì)胞的作用。

在植物感染的前線

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，外泌體以在相鄰細(xì)胞之間攜帶信號而聞名，但它們還具有許多其他功能，例如將抗菌分子傳遞給入侵的細(xì)菌。當(dāng)考慮外泌體在植物中的潛在作用時(shí)，Innes清楚地看到一些免疫功能是最好的起點(diǎn)。畢竟，他首先注意到外胚胎在持續(xù)感染期間被釋放，而其他關(guān)于MVB的研究表明，這些結(jié)構(gòu)在受感染的植物中更為普遍。5,6

為了測試外泌體在植物防御中的作用，Rutter感染了他的一半擬南芥植物細(xì)菌病原體。然后，他從感染和未感染的植物中分離出外泌體 - 總共約2,000種植物 - 并通過質(zhì)譜分析其內(nèi)容物。受感染的植物確實(shí)在其質(zhì)外體中含有更多的外泌體，但I(xiàn)nnes說這可能是因?yàn)楦腥緯茐募?xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物逃逸，而不是由于外泌體產(chǎn)生增加。并且質(zhì)譜結(jié)果同樣是模棱兩可的，來自感染和未感染植物的外來體顯示與全細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量相比，參與植物應(yīng)激反應(yīng)和免疫的蛋白質(zhì)的富集。這首先讓Innes感到驚訝，但他說這可能表明植物在感染開始時(shí)不會迅速形成新的囊泡，而只是使用現(xiàn)有的任何物質(zhì)。“我現(xiàn)在更多地將它們視為預(yù)制武器庫，

Innes和Rutter的研究很快被布宜諾斯艾利斯馬德普拉塔國立大學(xué)Laura de la Canal領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)小組跟蹤，他們?nèi)ツ陥?bào)告說，來自向日葵的細(xì)胞外囊泡中幾種防御相關(guān)蛋白的水平高于在植物周圍的質(zhì)外體。7同一組在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)向日葵外泌體與真菌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外泌體以某種方式進(jìn)入真菌細(xì)胞并抑制真菌生長。

Jin對外泌體可能帶入真菌以限制病原體的生長有一些想法。她的大部分職業(yè)生涯都在研究植物如何使用RNA來控制病原體防御途徑中涉及的基因的表達(dá)。例如，短片RNA可以結(jié)合信使RNA的互補(bǔ)鏈以防止它們參與蛋白質(zhì)的組裝，這一過程稱為RNA干擾。這些短RNA可以在產(chǎn)生它們的細(xì)胞內(nèi)或在植物的其他細(xì)胞內(nèi)起作用。近年來，Jin的團(tuán)隊(duì)和其他人發(fā)現(xiàn)，植物甚至可以將其RNA轉(zhuǎn)化為入侵的病原體以阻止這種攻擊，這種現(xiàn)象稱為宿主誘導(dǎo)的基因沉默。但多年來，尚不清楚這些RNA如何從植物細(xì)胞到真菌細(xì)胞，反之亦然。

參見“ 王國之間的RNA干擾 ”

Jin和她的團(tuán)隊(duì)在去年報(bào)告擬南芥植物使用外泌體向入侵的真菌細(xì)胞中提供短干擾RNA 時(shí)，將這種不確定性放在了床上。8研究人員使用類似于Innes的方案，通過僅在植物中發(fā)現(xiàn)的膜融合蛋白以及與四跨膜蛋白具有同源性的蛋白質(zhì)鑒定外泌體，四跨膜蛋白是在哺乳動(dòng)物外泌體上發(fā)現(xiàn)的一組蛋白質(zhì)。研究人員還將真菌細(xì)胞與植物外泌體一起培養(yǎng)，以產(chǎn)生GFP標(biāo)記的四跨膜蛋白，果然，真菌細(xì)胞在紫外線下發(fā)出綠光，表明它們必須攝入外泌體。當(dāng)Jin的團(tuán)隊(duì)用Botrytis 感染擬南芥植物時(shí)真菌，研究人員在真菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了42種不同的植物來源的短RNA。然后他們從純化的擬南芥外泌體中分離出RNA，并在其中發(fā)現(xiàn)了31個(gè)相同的短RNA，這表明超過70%的進(jìn)入真菌細(xì)胞的植物RNA使用外泌體作為其渡輪。

“因此，這有點(diǎn)回答圍繞宿主誘導(dǎo)基因沉默的整個(gè)概念的長期困惑，”Innes說。

植物缺乏哺乳動(dòng)物的外泌體加載機(jī)制

雖然他們的重點(diǎn)迄今一直是外泌體在植物防御中的作用，但Jin和Innes都在追求其他未發(fā)現(xiàn)的囊泡功能。例如，Jin的團(tuán)隊(duì)不僅在葉子質(zhì)外體中發(fā)現(xiàn)了植物外泌體，而且在韌皮部中發(fā)現(xiàn)了植物外泌體，韌皮部是在整個(gè)植物中運(yùn)輸糖和其他可溶性物質(zhì)的組織。“這意味著他們正在遠(yuǎn)距離移動(dòng)，”她說。

外泌體可能是植物細(xì)胞之間通信的主要途徑。大約一半的已知細(xì)胞外植物蛋白缺乏蛋白質(zhì)所需的肽序列，以便通過胞吐作用穿梭于細(xì)胞外。沒有這種肽信號，目前還不清楚這些蛋白質(zhì)是如何進(jìn)入質(zhì)外體的。Jin說幾個(gè)研究小組已經(jīng)聯(lián)系了她，要求他們幫助純化外泌體，以確定這些無信號蛋白質(zhì)是否通過在外泌體內(nèi)移動(dòng)來補(bǔ)償它們?nèi)狈μ厥怆男蛄小?/p>

同時(shí)，Innes說他想知道外泌體和其他細(xì)胞外囊泡是否有助于植物發(fā)育。在來自向日葵質(zhì)外體的細(xì)胞外囊泡中，de la Canal的研究小組發(fā)現(xiàn)了幾種參與細(xì)胞壁重組的酶，這對植物的生長和發(fā)育非常重要。7

但即使研究人員更多地了解外泌體可以做什么，尼爾森和他的許多同事也更關(guān)心他們?nèi)绾巫龅竭@一點(diǎn)。盡管植物和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸是相似的，但是存在一些關(guān)鍵差異，這使得植物生物學(xué)家感到有點(diǎn)難過。例如，在哺乳動(dòng)物中，稱為早期內(nèi)體的囊泡充當(dāng)囊泡在細(xì)胞周圍進(jìn)出的途徑。早期內(nèi)體中的特殊蛋白質(zhì)復(fù)合物分類并將載體裝載到囊泡中，包括MVB，并確定囊泡是否注定要將其貨物運(yùn)輸?shù)饺芙怏w中以被破壞或?qū)①|(zhì)膜從細(xì)胞中釋放出來。Nielsen說，植物沒有早期內(nèi)涵體，它提出了一個(gè)問題，它們的外泌體是如何形成的，載有蛋白質(zhì)和RNA，并被打包成MVBs，哪個(gè)被送到質(zhì)膜?“我們?nèi)栽谂ε宄烤拱l(fā)生了什么，”他說。

盡管缺乏知識，研究人員已經(jīng)開始考慮如何將植物外泌體用于農(nóng)業(yè)目的。例如，Jin說，通過確定天然植物外泌體用于滲透其病原體的特征，科學(xué)家理論上可以制造人工外泌體，用人造抗真菌短RNA或其他抗菌劑加載它們，并用它們來保護(hù)作物?？紤]到醫(yī)學(xué)應(yīng)用，一些研究小組正在研究所謂的外泌體樣納米粒子，這些納米粒子被認(rèn)為在攝取植物材料后將植物microRNA和蛋白質(zhì)傳遞到人類和動(dòng)物的腸道組織中。9,10迄今為止的研究暗示了這些囊泡的治療益處，例如激活小鼠腸道細(xì)胞中的抗炎基因9或保護(hù)小鼠免受酒精誘導(dǎo)的肝損傷。11最近的一項(xiàng)研究表明，從生姜中分離的外來體樣顆粒輸送微RNA小鼠腸道細(xì)菌，改變細(xì)菌的蛋白質(zhì)生產(chǎn)和保護(hù)小鼠免受結(jié)腸炎的癥狀。12

Innes說這些外來體樣顆粒只是從整個(gè)均質(zhì)化的植物組織中分離出來的，這意味著它們代表細(xì)胞內(nèi)外的囊泡。因此，目前尚不清楚外泌體 - 離開細(xì)胞的唯一囊泡 - 是否真的攜帶可影響人類生物學(xué)的蛋白質(zhì)或RNA。Innes的小組希望通過在擬南芥中純化的外泌體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中的癌細(xì)胞，并尋找細(xì)胞基因表達(dá)的變化，從而為這個(gè)問題帶來一些清晰度。

對于Innes來說，這些新項(xiàng)目是完全未知的領(lǐng)域。“老實(shí)說，六年前我從未想過細(xì)胞外囊泡，”他說。“這是我們打算做的事情的完全轉(zhuǎn)移。”隨著對植物外泌體的研究繼續(xù)聚集蒸汽，Innes說他并不孤單。“我認(rèn)為這為一系列不同的實(shí)驗(yàn)室開辟了新的研究方向。”