正如醫(yī)生尋求用超聲波檢查，CT和MRI掃描更深入身體，天文學(xué)家利用太空望遠(yuǎn)鏡，自適應(yīng)光學(xué)器件和不同波長的光線尋求進(jìn)一步觀察宇宙，神經(jīng)科學(xué)家尋求新的方法來觀察腦細(xì)胞深入大腦內(nèi)部。最近出現(xiàn)了三光子顯微鏡，讓他們比以往更深入地了解腦細(xì)胞?，F(xiàn)在，基于對該技術(shù)的實(shí)質(zhì)性改進(jìn)，麻省理工學(xué)院的科學(xué)家們已經(jīng)開展了第一項(xiàng)研究，通過每個(gè)視覺皮層，特別是下面神秘的“亞板”，喚醒老鼠的刺激神經(jīng)活動(dòng)。

“通過優(yōu)化光學(xué)設(shè)計(jì)和其他參數(shù)，以便在大腦中進(jìn)行測量，我們能夠?qū)嶋H制作以前無法實(shí)現(xiàn)的新發(fā)現(xiàn)，”共同通訊作者，皮科爾研究所牛頓神經(jīng)科學(xué)教授Mriganka Sur表示。學(xué)習(xí)和記憶。該論文的共同主要作者是博士后Murat Yildirim和Hiroki Sugihara。另一位通訊作者是機(jī)械工程和生物工程教授Peter So。

“這個(gè)概念已經(jīng)存在，但問題是你如何讓它發(fā)揮作用，”蘇爾說。

該研究發(fā)表在Nature Communications上，研究小組表明，當(dāng)老鼠觀察視覺刺激時(shí)，他們的人類觀察者可以測量所有六層視皮層和亞板中神經(jīng)元之間的活動(dòng)模式，提供有關(guān)它們在哺乳動(dòng)物如何處理中的作用的新數(shù)據(jù)視力。此外，通過一系列仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)??，研究人員能夠證明他們發(fā)出的光線，以及回來的光線，既沒有損壞，也沒有改變他們測量的細(xì)胞。

總之，本文描述了一種新型三光子顯微鏡，該顯微鏡經(jīng)過優(yōu)化，能夠提供快速，短，低功率的光脈沖，能夠在不引起任何功能性干擾或物理損傷的情況下到達(dá)深部目標(biāo)，然后檢測由細(xì)胞發(fā)出的熒光。高效率地生成具有清晰分辨率和快速幀速率的圖像。

“我們有動(dòng)力展示我們可以用三光子顯微鏡技術(shù)處理清醒狀態(tài)下的動(dòng)物，這樣我們就可以提出神經(jīng)科學(xué)的重要問題，”Yildirim說。“你可以認(rèn)為你擁有世界上最好的顯微鏡，但在你問這些問題之前，你不知道你會(huì)得到什么結(jié)果。”

飛秒和納焦耳

多光子顯微鏡背后的理論可以追溯到1931年Maria Goeppert-Mayer的博士論文，他的研究表明，低能光子的同時(shí)組合可以將原子或分子激發(fā)到更高的能量狀態(tài)，就像單個(gè)更高能量的光子一樣可以。1990年，康奈爾大學(xué)的科學(xué)家們將這種洞察力應(yīng)用于雙光子顯微鏡中的生物成像，并在2013年再次應(yīng)用三光子示波器。這些允許神經(jīng)科學(xué)家更深入地觀察大腦，因?yàn)檩^低能量，較高波長的光子比較高能量，較短波長的光子更不容易被細(xì)胞分子如脂質(zhì)散射。

Sur和So在麻省理工學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室加入了推動(dòng)多光子顯微鏡的前沿。在新的研究中，他們表明他們現(xiàn)在已經(jīng)足夠遠(yuǎn)，可以研究活體神經(jīng)活動(dòng)。為此，該團(tuán)隊(duì)試圖根據(jù)他們成像的腦組織特性的細(xì)致測量，改進(jìn)激光和示波器光學(xué)系統(tǒng)的許多不同參數(shù)。例如，他們不僅測量了細(xì)胞開始顯示明顯損傷的能量(約10納焦耳)，還測量了細(xì)胞開始表現(xiàn)不同的能量，從而產(chǎn)生受測量影響的數(shù)據(jù)(2至5納焦耳) 。憑借精確度和目的，提供更低的能量水平，科學(xué)家優(yōu)化了范圍，發(fā)出令人難以置信的短脈沖光，持續(xù)時(shí)間僅為40毫秒的“脈沖寬度”，

史無前例的神經(jīng)科學(xué)

在仔細(xì)驗(yàn)證優(yōu)化的三光子示波器的測量結(jié)果與雙光子示波器(在皮層較淺的層)和電生理學(xué)(可以更深入，但是盲目地)的測量結(jié)果一致之后，該團(tuán)隊(duì)開始做一些前所未有的神經(jīng)科學(xué) - 直接目視觀察清醒，表現(xiàn)動(dòng)物的所有皮層中的神經(jīng)活動(dòng)。

在實(shí)驗(yàn)室中，他們向小鼠顯示了12個(gè)不同旋轉(zhuǎn)方向的一些光柵圖案和屏幕上的兩個(gè)運(yùn)動(dòng)方向。通過優(yōu)化的三光子范圍，他們觀察了皮層每層中的神經(jīng)元 - 超過一毫米深 - 看看細(xì)胞如何對這種標(biāo)準(zhǔn)視覺輸入作出反應(yīng)。他們可以看到細(xì)胞的活性，因?yàn)樗麄兪褂妹麨镚CaMP6s的標(biāo)簽將它們設(shè)計(jì)為在鈣活性升高時(shí)發(fā)光。他們可以通過稱為“三次諧波產(chǎn)生”的現(xiàn)象看到其他組織，如血管和白質(zhì)。

他們能夠看到最深的層，他們觀察到第5層神經(jīng)元被“廣泛地”調(diào)整為方向，這意味著它們可以響應(yīng)各種各樣的方向，而不僅僅是一個(gè)或兩個(gè)特定的方向。第5層神經(jīng)元也比其他層中的細(xì)胞具有更多的自發(fā)活動(dòng)，并且與大腦更深部分的連接更多。同時(shí)，第6層神經(jīng)元的定向調(diào)整比其他層中的神經(jīng)元稍微更清晰，這意味著它們對不同方向的響應(yīng)更具特異性。

Subplate驚喜

他們最令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，亞板是一層薄薄的神經(jīng)“白質(zhì)”纖維，是一群神經(jīng)元的家園，其活動(dòng)模式微弱且廣泛地適應(yīng)視覺輸入。研究人員說，這一發(fā)現(xiàn)具有啟發(fā)性，因?yàn)樵S多神經(jīng)科學(xué)家認(rèn)為，亞板神經(jīng)元在發(fā)育過程中大多只是活躍的。Yildirim說，這層也太薄了，用電生理學(xué)測量。

“到目前為止，由于在體內(nèi)成像這些細(xì)胞的技術(shù)挑戰(zhàn)，成熟大腦中的亞板神經(jīng)元尚未被研究過，”研究人員寫道。

Sugihara回憶起Yildirim第一次向他展示亞板神經(jīng)元在成熟小鼠中是活躍的。“他們在那里做什么?” 他回憶起驚訝地問道。

現(xiàn)在他們繼續(xù)使用他們的新范圍來回答這個(gè)問題。

美國國立衛(wèi)生研究院，國家科學(xué)基金會(huì)，Picower研究所工程合作撥款和馬薩諸塞州生命科學(xué)倡議支持該研究。