加州大學(xué)舊金山分校和斯坦福大學(xué)的研究人員首次對細(xì)菌生命必需的中心基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行了全面調(diào)查。該研究結(jié)合了CRISPR基因編輯技術(shù)的新變種與自動(dòng)細(xì)胞成像，產(chǎn)生了對基因基因網(wǎng)絡(luò)的新認(rèn)識，這些基因網(wǎng)絡(luò)使細(xì)菌對環(huán)境壓力具有更強(qiáng)的抵抗力，并且越來越多地應(yīng)用于抗菌藥物。該研究還證明了一種確定潛在新抗生素化合物作用機(jī)制的實(shí)用方法，研究人員希望可以利用這種方法來幫助設(shè)計(jì)更好的藥物來對抗日益增長的抗生素耐藥性流行病。

復(fù)雜生命的大多數(shù)核心方面，例如細(xì)胞如何復(fù)制DNA，繁殖和制造關(guān)鍵蛋白質(zhì)和膜，都是基于簡單的單細(xì)胞細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的相同基因和蛋白質(zhì)機(jī)制。但即使在細(xì)菌中，所有這些蛋白質(zhì)如何協(xié)同作用以促進(jìn)生命只是部分被理解。在這項(xiàng)新研究中，由UCSF細(xì)胞生物學(xué)家Carol Gross博士和斯坦福生物工程師KC Huang博士和Stanley Qi博士領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)利用他們在微生物學(xué)，細(xì)胞成像和基因工程方面的綜合專業(yè)知識開發(fā)了一種新的方法。了解是什么讓細(xì)菌發(fā)癢。

“以前，生命中最基本的基因的遺傳學(xué)研究非常具有挑戰(zhàn)性，”加州大學(xué)圣地亞哥分校牙科學(xué)院細(xì)胞和組織生物學(xué)以及微生物學(xué)和免疫學(xué)教授格羅斯說。Gross說，遺傳學(xué)家經(jīng)常通過實(shí)驗(yàn)關(guān)閉基因并觀察細(xì)胞在所謂的“敲除”實(shí)驗(yàn)中發(fā)生的事情來了解基因的功能。“研究最基本的基因的問題是，你無法將它們擊倒 - 細(xì)胞就會死亡。”

2016年5月26日在線發(fā)表在Cell雜志上的新研究結(jié)果依賴于一種新技術(shù)，該技術(shù)允許研究人員對每種感興趣的基因產(chǎn)生“擊倒”。與敲除的二進(jìn)制開關(guān)開關(guān)不同，敲除實(shí)驗(yàn)基本上在每個(gè)基因上放置一個(gè)音量旋鈕，以溫和地調(diào)低細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量。通過這種方式，研究人員可以調(diào)低必需基因的活性，足以檢查其在細(xì)胞日?；顒?dòng)中的重要性，但不足以徹底殺死細(xì)胞。

這項(xiàng)稱為CRISPR干擾(CRISPRi)的技術(shù)最近由Qi公司開發(fā)，他現(xiàn)在是斯坦福大學(xué)工程與醫(yī)學(xué)院的生物工程和化學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)助理教授，當(dāng)時(shí)他是加州大學(xué)舊金山分校的系統(tǒng)生物學(xué)研究員。Qi的CRISPRi技術(shù)與CRISPR-Cas9技術(shù)完全不同，后者被基因工程師越來越多地用作切割和剪接DNA的簡單工具：CRISPRi不是修飾DNA，而是精確調(diào)節(jié)細(xì)胞特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。

研究人員使用CRISPRi系統(tǒng)地減少細(xì)菌枯草芽孢桿菌中258種必需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，每次一種基因，然后觀察細(xì)胞機(jī)器如何在這種弱化狀態(tài)下使用高通量，計(jì)算機(jī)控制的顯微鏡進(jìn)行研究由黃的實(shí)驗(yàn)室。

研究人員發(fā)現(xiàn)，對于絕大多數(shù)必需蛋白質(zhì)而言，蛋白質(zhì)完全喪失會對細(xì)胞的完整性造成嚴(yán)重破壞：使其正常形狀發(fā)生變形或?qū)е滤鼈儽巡⑵茐募?xì)胞分裂或完全停止生長。相比之下，使用CRISPRi部分剝奪這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞產(chǎn)生了微妙的變化，并揭示了必需蛋白質(zhì)分為兩類：通過直接控制細(xì)菌細(xì)胞壁改變細(xì)胞形狀的蛋白質(zhì)，以及通過間接影響細(xì)胞形狀的調(diào)節(jié)劑機(jī)制。

“這些研究結(jié)果揭示了一系列可以通過抗生素靶向的失敗模式，并展示了細(xì)胞如何進(jìn)化以將它們的系統(tǒng)結(jié)合起來以避免這些命運(yùn)，”斯坦福大學(xué)工程學(xué)院生物工程和微生物學(xué)與免疫學(xué)教授Huang說。和醫(yī)學(xué)。

遺傳冗余和失敗保險(xiǎn)是細(xì)菌恢復(fù)力的關(guān)鍵

該團(tuán)隊(duì)還對100多種不同的壓力進(jìn)行了每次擊倒，例如給予抗生素或改變其營養(yǎng)供應(yīng)。通過分析近30,000種基本蛋白質(zhì)敲除和環(huán)境壓力因素的組合，該團(tuán)隊(duì)描述了不同基本蛋白質(zhì)對應(yīng)對特定環(huán)境壓力因子的重要性，并觀察了細(xì)菌復(fù)原力的一些關(guān)鍵原則。他們還表明，該技術(shù)有可能被用于確定新抗生素化合物的生物學(xué)機(jī)制。

為了測試他們作為藥物發(fā)現(xiàn)平臺的方法，研究人員證明了對構(gòu)建細(xì)菌細(xì)胞壁重要的特定酶的敲低使得細(xì)胞對抗生素特別敏感，其抗生素的作用方式以前是未知的。該團(tuán)隊(duì)表示，此類實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了同時(shí)研究所有必需基因的能力，他們認(rèn)為這種方法可以成為描述其他抗生素藥物目標(biāo)的有效方法，這是將藥物從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室的主要瓶頸。診所。

其他實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出許多冗余 - 例如產(chǎn)生更多的每種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，而不是作為饑餓時(shí)間的雨天供應(yīng)。研究人員了解到，細(xì)菌還可以備份許多必需蛋白質(zhì)，這是一種自動(dòng)防故障機(jī)制，可以更好地抵抗基因突變或藥理攻擊。

例如，一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)側(cè)重于已知在產(chǎn)生細(xì)菌細(xì)胞保護(hù)性外層中起關(guān)鍵作用的三種蛋白質(zhì)，這是一種由幾種最有效的抗生素靶向的重要過程。

“我們把第一個(gè)蛋白質(zhì)從完全爆炸變?yōu)榱?，?xì)胞很好，”格羅斯說。“我們對第二種蛋白質(zhì)做了同樣的事情，但事情仍然很好。我們不得不在細(xì)胞死亡之前擊倒所有三種蛋白質(zhì)。因此，雖然這個(gè)過程是必不可少的，但每種蛋白質(zhì)都沒有。”

該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十對具有看似無關(guān)功能的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)對環(huán)境壓力具有相似水平的彈性，這表明細(xì)胞具有冗余備份系統(tǒng)，可以處理關(guān)鍵系統(tǒng)的中斷。

“在某種程度上，這些實(shí)驗(yàn)使我們能夠通過觀察每個(gè)生命過程的結(jié)果來逆向改造進(jìn)化，”黃說。“我們的研究結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)過優(yōu)化可以在逆境中存活。鑒于通常在細(xì)菌進(jìn)化過程中，營養(yǎng)素供應(yīng)短缺，環(huán)境條件惡劣。因此必需的基因和蛋白質(zhì)會進(jìn)化，使細(xì)胞在細(xì)胞生存期間存活。缺乏。”