雙光子激光掃描顯微鏡成像通常用于研究哺乳動(dòng)物大腦中細(xì)胞和亞細(xì)胞分辨率下的神經(jīng)元活性。這樣的研究還僅限于大腦的單個(gè)功能區(qū)域。在最近的報(bào)告中，中國(guó)，德國(guó)和英國(guó)的神經(jīng)科學(xué)研究所，神經(jīng)科學(xué)研究所，系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)與光學(xué)系統(tǒng)先進(jìn)制造技術(shù)中心腦研究?jī)x器創(chuàng)新中心的Mengke Yang及其同事開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為多區(qū)域兩光子實(shí)測(cè)技術(shù)的新技術(shù)。時(shí)間體外探索器(MATRIEX)。該方法允許用戶以直徑約200 µm的視場(chǎng)(FOV)瞄準(zhǔn)功能性大腦的多個(gè)區(qū)域，以執(zhí)行雙光子Ca 2+ 在所有區(qū)域同時(shí)以單細(xì)胞分辨率成像。

楊等。進(jìn)行了小鼠麻醉和清醒狀態(tài)下初級(jí)視覺(jué)皮層，初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層和海馬CA1區(qū)單神經(jīng)元活動(dòng)的實(shí)時(shí)功能成像。MATRIEX技術(shù)可以使用單個(gè)激光掃描設(shè)備來(lái)唯一配置多個(gè)微觀FOV。結(jié)果，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)為現(xiàn)有的傳統(tǒng)單光束掃描，雙光子顯微鏡中的附加光學(xué)模塊，而無(wú)需進(jìn)行其他修改。MATRIEX可用于探索體內(nèi)多區(qū)域神經(jīng)元活動(dòng)，從而具有單細(xì)胞分辨率的全腦神經(jīng)回路功能。

雙光子激光顯微鏡起源于1990年代，在對(duì)研究體內(nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能感興趣的神經(jīng)科學(xué)家中很流行?；铙w大腦的兩光子和三光子成像的主要優(yōu)勢(shì)包括在密集標(biāo)記的大腦組織中實(shí)現(xiàn)的光學(xué)分辨率，該組織強(qiáng)烈散射光，在此期間可以掃描并以最小的串?dāng)_獲取光學(xué)切片的圖像像素。然而，通過(guò)防止在特定距離內(nèi)同時(shí)觀察兩個(gè)物體，優(yōu)點(diǎn)也給該方法帶來(lái)了明顯的缺點(diǎn)。研究人員以前實(shí)施了許多策略擴(kuò)展限制，但是這些方法很難在神經(jīng)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。然而，在神經(jīng)科學(xué)中，以體內(nèi)單細(xì)胞分辨率研究全腦神經(jīng)元功能的需求越來(lái)越高。

通過(guò)一種簡(jiǎn)單的方法，科學(xué)家可以將兩個(gè)顯微鏡放在同一個(gè)動(dòng)物的大腦上方，以同時(shí)對(duì)皮層和小腦進(jìn)行成像。但是這樣的努力會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜性和成本的大幅增加。因此，目前對(duì)性能和可行性的高期望值提出了一個(gè)極富挑戰(zhàn)性的工程問(wèn)題，即單個(gè)成像系統(tǒng)如何可以同時(shí)從體內(nèi)多個(gè)大腦區(qū)域同時(shí)獲取實(shí)時(shí)顯微圖像。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Yang等。介紹了一種結(jié)合了兩級(jí)放大和多軸光學(xué)耦合的新方法。

他們實(shí)現(xiàn)了使用低倍率干物鏡(DO)的方法，在干物鏡下有多個(gè)浸入水中的微型物鏡(MO)。科學(xué)家將每個(gè)MO置于大腦組織中所需的目標(biāo)位置和深度。該團(tuán)隊(duì)使用了新的復(fù)合物組件，類(lèi)似于原始的水浸顯微鏡物鏡，而沒(méi)有對(duì)圖像掃描和采集子系統(tǒng)進(jìn)行其他修改。

他們使用兩個(gè)原理實(shí)現(xiàn)了MATRIEX方法：兩級(jí)放大和多軸耦合。例如，僅使用干物鏡(DO)進(jìn)行兩級(jí)放大，他們觀察到20 µm的珠子是微小的模糊點(diǎn)，同時(shí)觀察了整個(gè)化合物組件的清晰圓形。在多軸耦合過(guò)程中，科學(xué)家將單個(gè)DO與同一圖像平面上的多個(gè)MO耦合。通過(guò)在單個(gè)矩形框架中進(jìn)行簡(jiǎn)單的光柵掃描，研究團(tuán)隊(duì)獲得了一個(gè)包含多個(gè)圓形FOV(視場(chǎng))的矩形圖像-其中每個(gè)FOV對(duì)應(yīng)一個(gè)MO，且FOV像素間的串?dāng)_最小。

科學(xué)家認(rèn)為數(shù)值孔徑(NA)的放大倍數(shù)可以使化合物組件具有更好的分辨率。相關(guān)的鏡頭也很靈活，可以定制設(shè)計(jì)用于低成本批量生產(chǎn)，以協(xié)助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。MATRIEX的主要功能是能夠以較大的深度間隔同時(shí)對(duì)多個(gè)對(duì)象進(jìn)行成像。為了突出這一點(diǎn)，Yang等。設(shè)計(jì)了具有不同參數(shù)的不同MO，并將它們放置在特定深度處，相應(yīng)的對(duì)象平面在同一軸上共軛。在實(shí)踐中，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分別沿z軸的每個(gè)方向調(diào)整MO來(lái)補(bǔ)償期望和實(shí)際物體深度之間的微小失配。

通常，在DO(干物鏡)下，目標(biāo)區(qū)域的最大橫向尺寸受掃描場(chǎng)的最大尺寸限制。例如，使用放大倍數(shù)為2倍且目標(biāo)區(qū)域直徑為12毫米的DO，科學(xué)家可以為整個(gè)成年小鼠的大腦成像。在這項(xiàng)研究中，Yang等。同時(shí)拍攝了小鼠的額葉皮層和小腦。實(shí)際上，一個(gè)4倍的空氣物鏡適合于獲得更好的分辨率以觀察精細(xì)的樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)。

作為原理的證明，研究小組使用MATRIEX對(duì)小鼠的初級(jí)視覺(jué)皮層(V1區(qū))，初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M1區(qū))和海馬CA1區(qū)的熒光標(biāo)記神經(jīng)元進(jìn)行了雙光子Ca 2+同步成像。在這三個(gè)MO的配置中，科學(xué)家將兩個(gè)適合V1和M1區(qū)的MO放置在皮質(zhì)的正上方，并在手術(shù)切除后將MO插入海馬CA1區(qū)皮質(zhì)組織。然后，團(tuán)隊(duì)為與V1，M1和CA1對(duì)應(yīng)的物平面設(shè)計(jì)了透鏡，以便在同一圖像平面上進(jìn)行共軛。使用配備12 kHz共振掃描器的兩光子顯微鏡，科學(xué)家們放大了三個(gè)不同的區(qū)域以解析單個(gè)神經(jīng)元后，掃描了整個(gè)圖像以觀察三個(gè)FOV及其單個(gè)細(xì)胞。然后，他們注意到激光功率將在多個(gè)FOV之間分配。

而楊等?？梢允褂脝蝹€(gè)大腦區(qū)域內(nèi)的常規(guī)單FOV成像獲得這些結(jié)果，因此MATRIEX技術(shù)為他們提供的數(shù)據(jù)超出了單FOV成像技術(shù)所提供的數(shù)據(jù)。綜上所述，這些結(jié)果使得小鼠的自發(fā)活動(dòng)模式從麻醉狀態(tài)到清醒狀態(tài)具有高度不均勻的分布和轉(zhuǎn)化，從而以單細(xì)胞分辨率跨越了全腦范圍的電路水平。

以這種方式，Menge Yang及其同事基于兩級(jí)放大和多軸光學(xué)耦合的原理開(kāi)發(fā)了MATRIEX技術(shù)。他們同時(shí)進(jìn)行了兩個(gè)光子的Ca 2+在單細(xì)胞分辨率下麻醉和清醒的小鼠中，在不同區(qū)域(V1，M1和CA1)不同深度的神經(jīng)元種群活動(dòng)中進(jìn)行成像。重要的是，可以將任何常規(guī)的兩光子顯微鏡轉(zhuǎn)換為MATRIEX顯微鏡，同時(shí)保留所有原始功能。轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵是基于復(fù)合物鏡組件的設(shè)計(jì)。研究人員可以使用精心設(shè)計(jì)的不同MO，以適應(yīng)MATRIEX技術(shù)與常規(guī)顯微鏡之間100%兼容的不同大腦區(qū)域。研究團(tuán)隊(duì)期望MATRIEX技術(shù)能夠以單細(xì)胞分辨率顯著提高三維，全腦神經(jīng)回路動(dòng)力學(xué)。