一個國際科學(xué)家小組報(bào)告了一種基于CRISPR的新工具的開發(fā)，該工具就像一臺碎紙機(jī)，能夠通過可編程定位去除人體細(xì)胞中的長片段DNA。他們在分子細(xì)胞 (“使用I型CRISPR-Cas引入人類胚胎干細(xì)胞的長程基因組缺失譜”中)描述了他們?nèi)绾纬晒Φ孬@得一種名為I型CRISPR-Cas3的不同類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)作為人體細(xì)胞中的遠(yuǎn)程DNA編輯工具。

據(jù)密歇根大學(xué)科學(xué)家Yan Zhang博士介紹，該技術(shù)提供了一種定位和刪除比現(xiàn)有Cas9工具更長的DNA范圍的方法。應(yīng)用包括基因研究，以了解疾病的基礎(chǔ)，并可能，治療與長鏈DNA相關(guān)的疾病。

“CRISPR-Cas系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)微生物適應(yīng)性免疫，并提供真核基因組編輯工具。這些工具使用II型或V型CRISPR的單一效應(yīng)酶來產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的精確基因組斷裂。在這里，我們證明使用I型CRISPR-Cas [在細(xì)菌中比在包括Cas9的II型變種中更常見]在人胚胎干細(xì)胞中利用單一RNA指導(dǎo)有效引入一系列遠(yuǎn)程染色體缺失的可行性。和HAP1細(xì)胞。I型CRISPR系統(tǒng)依靠多亞基核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物Cascade來鑒定DNA靶標(biāo)和解旋酶 - 核酸酶Cas3以逐步降解DNA，“研究者寫道。

“通過RNP傳遞T. fuscaCascade和Cas3，我們獲得了13-60%的編輯效率?；陂L程PCR和基于高通量測序的病變分析顯示，在靶位點(diǎn)的上游產(chǎn)生了從幾百堿基對到100千堿基的各種缺失。這些結(jié)果突出了I型CRISPR-Cas在真核生物中進(jìn)行遠(yuǎn)程基因組操作和缺失篩選的潛在效用。“

蛋白質(zhì)優(yōu)化和純化方面的工作是在康奈爾大學(xué)教授Ailong Ke博士的實(shí)驗(yàn)室完成的，他是該論文的共同通訊作者?？的螤柎髮W(xué)研究生亞當(dāng)杜蘭和密歇根大學(xué)高級研究專家侯中剛博士是該論文的第一作者。

Zhang研究了細(xì)菌CRISPR-Cas9并開發(fā)了用于編輯人類細(xì)胞遺傳物質(zhì)的工具。Ke使用結(jié)構(gòu)和生化方法檢查了I型CRISPR。

該團(tuán)隊(duì)開始嘗試將細(xì)菌CRISPR組分作為蛋白質(zhì)傳遞到人類胚胎干細(xì)胞和HAP1細(xì)胞中。通過一個CRISPR指南，該團(tuán)隊(duì)成功地刪除了從幾百堿基對到100千堿基的靶DNA的部分。

張稱Cascade-Cas3系統(tǒng)是“帶有馬達(dá)的DNA粉碎機(jī)”，因?yàn)樗梢匝刂鳧NA基因組移動一定距離，隨著時間的推移分解遺傳物質(zhì)。

密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)助理教授張說：“Cas9是一種分子剪刀，可以在你想要的地方剪斷，并剪一次。”“但Cas3可以到達(dá)您想要的地方，沿著染色體傳播，并且可以進(jìn)行數(shù)十千堿基的刪除。這可以使它成為一個強(qiáng)大的篩選工具，以確定哪些大面積的DNA對特定疾病最重要。“

當(dāng)科學(xué)家研究不含特定蛋白質(zhì)代碼的非編碼長鏈DNA時，這可能特別有用;張先生繼續(xù)說道，碎紙機(jī)技術(shù)可以讓它們拆除一系列長時間的延伸，看看會發(fā)生什么。

此外，她補(bǔ)充說，Cas3在染色體上長距離傳播的能力無法通過任何現(xiàn)有的Cas9技術(shù)完成。因此，Cas3的“核酸酶死亡”版本可以沿DNA傳播但缺乏粉碎功能，可能為遠(yuǎn)程表觀基因組工程提供強(qiáng)大的傳遞平臺，Zhang解釋說。

部分研究工作涉及如何獲得人類干細(xì)胞以揭示是否已經(jīng)刪除任何DNA，因?yàn)槿绻兴榛钚缘停蠖鄶?shù)涉及CRISPR-Cas9的研究開發(fā)的干細(xì)胞報(bào)告系列都不夠靈敏。澳大利亞墨爾本大學(xué)的Sara Howden博士致力于構(gòu)建一種敏感的雙報(bào)告細(xì)胞系。

該團(tuán)隊(duì)的另一個挑戰(zhàn)是弄清楚破碎機(jī)在完成契約后切碎了什么，使用下一代DNA測序并超越現(xiàn)有方法來查看Cas9產(chǎn)生的編輯。

Hou開發(fā)了一種基于轉(zhuǎn)座酶的分析方法，密歇根大學(xué)生物化學(xué)，計(jì)算醫(yī)學(xué)和生物信息學(xué)助理教授Peter Freddolino博士建立了定制信息學(xué)管道來分析深度測序結(jié)果。

Ke還在論文中指出，因?yàn)樾枰嬖V碎紙機(jī)去哪里的指導(dǎo)RNA序列比CRISPR-Cas9系統(tǒng)中使用的序列更長，并且因?yàn)槟繕?biāo)搜索和降解是兩個分離良好的步驟，所以新方法是可能更好地控制。柯說，可能不太可能在他們不想要的地方做出錯誤的削減。

Zhang推測，這種新工具及其衍生物可用于治療目的，但這種用途在未來數(shù)年內(nèi)會有所用。

已經(jīng)報(bào)道了一些基于CRISPR-Cas9的治療用途，包括有爭議的編輯受體基因，使得HIV能夠進(jìn)入據(jù)報(bào)在中國出生的兩個嬰兒的胚胎中的細(xì)胞。但是對于CRISPR-Cas9在人類患者DNA的正常區(qū)域進(jìn)行無意識編輯的擔(dān)憂也浮出水面。需要進(jìn)一步的工作來確定碎紙機(jī)方法是否避免了這個問題。