在對抗侵入日常生活的病毒的斗爭中，觀察和理解戰(zhàn)場至關(guān)重要。莫格里奇研究所的科學(xué)家們首次對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成像，這些分子結(jié)構(gòu)對于一大類病毒如何在受感染的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制至關(guān)重要。“挑戰(zhàn)有點(diǎn)像是一名汽車修理工，無法看到引擎或它是如何詳細(xì)組合的，”Morgridge研究所病毒學(xué)主任，大學(xué)腫瘤學(xué)和分子病毒學(xué)教授Paul Ahlquist說。威斯康星 - 麥迪遜。“這項(xiàng)工作是我們第一次看到發(fā)動機(jī)。”

該研究于6月27日發(fā)表在eLife雜志上，采用開創(chuàng)性的低溫電子斷層掃描技術(shù)，以生動的細(xì)節(jié)揭示復(fù)雜的病毒復(fù)制過程，開辟了可能破壞，拆除或重定向病毒機(jī)制的新途徑。Ahlquist實(shí)驗(yàn)室的幾個(gè)目標(biāo)之一是了解正鏈RNA病毒的基因組復(fù)制，正鏈RNA病毒是包括許多人類病原體的最大遺傳類病毒，如寨卡病毒，登革熱病毒，非典型肺炎病毒和基孔肯雅病毒。該小組以戰(zhàn)略方式研究過程，不是關(guān)注單個(gè)重要病毒的細(xì)節(jié)，而是關(guān)注適用于整個(gè)班級的大型原則。

為什么要關(guān)注基因組復(fù)制?

“大多數(shù)病毒基因組，通常約為75%，被用于基因組復(fù)制，”Ahlquist說。“病毒告訴我們 - 用最寶貴的資源投票，它的編碼能力 - 這是感染的重要工作。”

該過程恰好發(fā)生在受感染細(xì)胞的膜上。病毒使復(fù)制區(qū) - 基本上是新的細(xì)胞器 - 在其中發(fā)生基因組復(fù)制過程。在Ahlquist實(shí)驗(yàn)室中用作模型的諾達(dá)病毒在線粒體膜上進(jìn)行該過程。

未感染的線粒體在其外部具有兩個(gè)膜。在感染病毒的線粒體中，這些膜之間的空間擴(kuò)大并充滿小球，圓形囊泡大小約為50納米。

“通過這種令人興奮的新結(jié)構(gòu)信息，我們可以更多地了解隔室的形成和功能，”Benefield說。“這些信息將有助于我們對病毒復(fù)制的理解，并提供有關(guān)如何控制它的見解。”

復(fù)制區(qū)室或小球包含RNA鏈，即病毒的遺傳密碼。正是在這些小球中發(fā)生了RNA合成。然后將產(chǎn)物RNA從小球中排出并用于制造更多蛋白質(zhì)，或者將其包裝成新的感染性顆粒以制造下一代病毒。

Benefield說，冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)的新用途使得科學(xué)家能夠以前所未有的細(xì)節(jié)看到復(fù)制室。

“我們能夠看到之前僅從生化和遺傳實(shí)驗(yàn)中推斷出的結(jié)構(gòu)元素，以及引人注目的新功能，這些都是前所未有的。”

傳統(tǒng)的電子顯微鏡有其局限性，需要對樣品進(jìn)行一系列嚴(yán)格的步驟：化學(xué)固定，重金屬染色和嵌入塑料中。使用高反應(yīng)性和危險(xiǎn)的化學(xué)品，過程緩慢，樣品固定，因此成像，處于不自然的狀態(tài)。

冷凍ET的樣品制備更簡單，產(chǎn)生更好的結(jié)果。將樣品在納秒內(nèi)快速冷凍成液體乙烷，用液氮冷卻。因?yàn)樗豢焖倮鋬?，所以樣品被困在一個(gè)更天然的狀態(tài)。水分子也沒有時(shí)間組織和結(jié)晶，所以冰是玻璃質(zhì)的，玻璃狀的。

雖然冷凍ET的冷凍部分改善了樣品制備，但斷層掃描組件通過創(chuàng)建3D可視化使成像更進(jìn)一步。使用傳統(tǒng)的電子顯微鏡，復(fù)制室看起來很細(xì)長，幾乎是足球形的。固定技術(shù)縮小了小球，它們的內(nèi)容萎縮了。Cryo-ET顯示了現(xiàn)實(shí) - 結(jié)構(gòu)非常圓，意味著它們像氣球一樣處于壓力之下，并且充滿了像紗球一樣包裹的RNA鏈。小球的大小根據(jù)被復(fù)制的RNA的長度而變化。

“我首先對這些結(jié)構(gòu)的美麗和優(yōu)雅感到震驚，”Benefield說。“我對這種病毒在復(fù)制RNA方面的效率以及它如何完全吸收宿主細(xì)胞線粒體以最終產(chǎn)生更多病毒感到驚訝。這是一種真正令人羞愧的工作中病原體幕后的瞥見。”

小球沿著線粒體膜有一個(gè)頸部，通向細(xì)胞質(zhì)。正是在這里復(fù)制RNA的成分進(jìn)入，產(chǎn)品問世。一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是存在一個(gè)位于頸部頂部的冠狀結(jié)構(gòu)。

該結(jié)構(gòu)是一個(gè)高度組織，高度對稱的杯子，外面有12顆牙齒。這是一個(gè)結(jié)構(gòu)特征，可能將所有東西放在一起。如果囊泡是壓力下的圓形氣球，則冠狀物就像綁在氣球的頸部。

新的結(jié)果進(jìn)一步表明，冠包含讀取和復(fù)制RNA鏈的病毒蛋白，并且可能代表基因組復(fù)制復(fù)合物的主要引擎。要完善這些冠的形狀和功能還有很多工作要做，但揭示它們的存在并對其結(jié)構(gòu)和對稱性進(jìn)行成像是朝著正確方向邁出的重要一步。

“如果我們想操縱和控制這些復(fù)合體，我們必須了解它們的詳細(xì)操作”，Ahlquist說。“如果你不知道它看起來是什么以及它是如何組合在一起的話，你無法理解它是如何發(fā)揮作用的。”

Ahlquist說，正RNA鏈病毒只是六種不同類別病毒中的一種。越來越明顯的是，復(fù)制隔室的形成，甚至可能是與冠相關(guān)的結(jié)構(gòu)，可能由多個(gè)類共享。

“雖然這些類別被認(rèn)為是非常不同的，但在基因組復(fù)制方面，六類中有三類存在相似之處，”Ahlquist說。“這具有進(jìn)化意義，使我們能夠整合來自不同系統(tǒng)的結(jié)果，以達(dá)到意想不到的新見解。”