在冷凍EM實驗期間將蛋白質(zhì)樣品置于電子顯微鏡下的常規(guī)方法在獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的最佳圖像時可能會失敗。根據(jù)Salk領(lǐng)導(dǎo)的一項新研究，在某些情況下，傾斜一片冷凍蛋白質(zhì) - 在顯微鏡下放置10到50度 - 提供更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并可以更好地了解各種疾病?？茖W(xué)家Dmitry Lyumkis。“人們之前曾試圖實施傾斜，但存在很多挑戰(zhàn)，”Salk研究所的Helmsley-Salk研究員，新作品的高級作者Lyumkis在7月3日出版的“ 自然方法”雜志上說。“我們用新的方法消除了許多這些問題。”

Cryo-EM或低溫電子顯微鏡是透射電子顯微鏡的一種形式，其中樣品在顯微鏡下成像之前快速冷卻至低于冰點。與通常用于確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的其他方法不同，冷凍EM使蛋白質(zhì)保持其天然構(gòu)象以進(jìn)行成像，這可以揭示有關(guān)結(jié)構(gòu)的新信息。了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是開發(fā)新的疾病治療方法的重要一步，例如艾滋病病毒。

長期以來，研究人員一直認(rèn)為蛋白質(zhì)在整個冷凍網(wǎng)格中采用隨機構(gòu)象，為冷凍EM實驗做好準(zhǔn)備，這意味著通過拍攝足夠的圖像，研究人員可以從所有成像方向整合出蛋白質(zhì)形狀的完整3D圖像。但是對于許多蛋白質(zhì)來說，這種方法似乎不足，而且部分蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)仍然缺失。

“研究人員開始認(rèn)為冷凍EM網(wǎng)格上的蛋白質(zhì)畢竟不采用隨機構(gòu)象，而是以優(yōu)選方向粘在樣本網(wǎng)格的頂部或底部，”Lyumkis說。“因此，我們可能無法全面了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。更重要的是，這種行為可以完全禁止選擇蛋白質(zhì)樣品的結(jié)構(gòu)測定。”

為了理解這個問題，想象一下，試著看看十幾個錫罐的陰影來弄清楚它們的形狀，但只能看到圓圈，因為所有的罐子都是直立的。通過制作光束或電子束，在低溫EM的情況下，以一定角度撞擊樣品，您將能夠更好地看到真實的形狀。

當(dāng)研究人員過去曾試圖在顯微鏡下傾斜樣品時，它們受到分辨率不佳的限制：角度意味著電子束必須穿過更厚的網(wǎng)格。當(dāng)樣本傾斜時，樣本也更有可能在凍結(jié)網(wǎng)格內(nèi)移動，從而模糊了數(shù)據(jù)。從技術(shù)上講，分析來自傾斜樣品的數(shù)據(jù)也更具挑戰(zhàn)性，因為低溫EM方法的設(shè)計假設(shè)含有蛋白質(zhì)的網(wǎng)格始終與顯微鏡的距離相同。

為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，Lyumkis和他的同事改變了用于創(chuàng)建低溫EM 網(wǎng)格的材料，記錄了他們的數(shù)據(jù)電影而不是靜態(tài)圖像，并開發(fā)了新的計算方法來分析信息。

當(dāng)他們測試流感血凝素蛋白的新方法時，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)傾斜樣本給出了更完整的數(shù)據(jù)集，這是一種眾所周知的硬蛋白，可以用冷凍EM來表征。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品是扁平的時，典型的算法會為蛋白質(zhì)引入假陽性形狀，而實驗數(shù)據(jù)并未對其進(jìn)行支持。當(dāng)它傾斜時，情況并非如此。

“由于我們傾斜時數(shù)據(jù)采集的幾何形狀，我們填充了更多數(shù)據(jù)表征分子，讓我們更完整地了解蛋白質(zhì)的形狀”Lyumkis說。

Lyumkis和他的團(tuán)隊開發(fā)的算法 - 包括分析低溫EM實驗是否引入不良數(shù)據(jù)的方法，以及解釋傾斜實驗的方法 - 現(xiàn)在已公開可用。他們希望其他研究人員開始使用它們，并且它成為低溫EM 結(jié)構(gòu)驗證的標(biāo)準(zhǔn)度量標(biāo)準(zhǔn)(因為大多數(shù)實驗衍生的結(jié)構(gòu)在不同程度上都會丟失信息)。

“我們現(xiàn)在關(guān)注的一個想法是，數(shù)據(jù)收集是應(yīng)該總是以傾斜而不是傳統(tǒng)的方式進(jìn)行，”Lyumkis說。“它不會受到傷害，它應(yīng)該有所幫助。”