加利福尼亞大學(xué)伯克利分校和馬薩諸塞州綜合醫(yī)院的科學(xué)家已經(jīng)確定了Cas9蛋白中的一個關(guān)鍵區(qū)域，該區(qū)域控制著CRISPR-Cas9在靶DNA序列中的準確程度，并對其進行了調(diào)整，以生成一個超精確的基因編輯器。迄今為止最低水平的脫靶切割。

研究人員說，研究人員認為，作為DNA切割主控制器的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是重新設(shè)計的明顯目標，可進一步提高準確性。這種方法應(yīng)該有助于科學(xué)家定制Cas9的變體 - 結(jié)合并切割DNA的蛋白質(zhì) - 以最小化CRISPR-Cas9在錯誤的位置編輯DNA的機會，這是在人類進行基因治療時的一個關(guān)鍵考慮因素。

實現(xiàn)提高準確度的一個策略是在控制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中創(chuàng)建稱為REC3的突變，并查看哪些突變提高了準確性而不影響目標切割的效率。

“我們發(fā)現(xiàn)即使是Cas9的REC3結(jié)構(gòu)域的微小改變也會影響目標編輯和非目標編輯之間的差異，這表明該結(jié)構(gòu)域是深入誘變以提高靶向特異性的明顯候選者。作為此的延伸可以在REC3中進行比我們所做的靶向突變更無偏見的誘變，“共同第一作者Janice Chen說，他是Jennifer Doudna實驗室的研究生，共同發(fā)明了CRISPR-Cas9基因編輯工具。

共同第一作者Chen，Yavuz Dagdas和Benjamin Kleinstiver以及他們在加州大學(xué)伯克利分校，馬薩諸塞州綜合醫(yī)院和哈佛大學(xué)的同事今天在線發(fā)表在Nature雜志上的報道。

超精確的Cas9

自2012年以來，分子和細胞生物學(xué)教授Doudna和加州大學(xué)伯克利分校的霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員，以及馬克斯普朗克感染生物學(xué)研究所的同事Emmanuelle Charpentier重新利用Cas9蛋白質(zhì)創(chuàng)造了一種便宜，精確且易于使用的方法。 - 使用基因編輯器，研究人員試圖減少脫靶編輯的機會。雖然提高保真度有利于基礎(chǔ)研究，但在編輯臨床應(yīng)用基因時絕對至關(guān)重要，因為任何脫靶DNA切割都可能使關(guān)鍵基因失效并導(dǎo)致永久性的意外副作用。

在過去兩年中，兩個團隊設(shè)計了高度準確的Cas9蛋白 - 一種稱為eSpCas9(1.1)的增強特異性和一種稱為SpCas9-HF1的高保真 - 而Chen和Doudna試圖了解為什么它們切割的特異性高于野生來自化膿性鏈球菌的Cas9蛋白在今天被廣泛使用。

目前，使用CRISPR-Cas9的研究人員創(chuàng)建了單指導(dǎo)RNA(sgRNA) - 一種RNA分子，其中包含20個核糖核酸鏈，這些核酸與其想要靶向的特定20核酸DNA序列互補，并將其連接到Cas9。該指導(dǎo)RNA允許Cas9置于互補DNA上，與其結(jié)合并切割雙鏈螺旋。但Cas9-sgRNA復(fù)合物也可以與不完全匹配的DNA結(jié)合，導(dǎo)致不希望的脫靶切割。

2015年，Doudna的實驗室發(fā)現(xiàn)了Cas9的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，當(dāng)RNA引導(dǎo)和DNA靶標匹配時，它會被激活。他們發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)RNA和DNA緊密匹配Cas9的3D結(jié)構(gòu)，特別是HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象時，才能改變并激活Cas9的剪刀。然而，負責(zé)檢測構(gòu)象轉(zhuǎn)換上游核酸的過程仍然未知。

在目前的研究中，Chen和Dagdas使用一種稱為單分子FRET(Förster共振能量轉(zhuǎn)移)的技術(shù)來精確測量Cas9-sgRNA蛋白復(fù)合物中的各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域 - 特別是REC3，REC2和HNH - 如何在復(fù)合物中移動與DNA結(jié)合。

他們首先確定eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1賦予的特異性益處可以解釋為這些Cas9變體的HNH構(gòu)象轉(zhuǎn)換閾值遠高于野生型Cas9蛋白，這使得eSpCas9成為可能。 (1.1)和SpCas9-HF1變體在結(jié)合脫靶序列時不太可能激活剪刀。

接下來，他們發(fā)現(xiàn)REC3結(jié)構(gòu)域負責(zé)檢測靶結(jié)合的準確性，然后發(fā)出REC2結(jié)構(gòu)域的向外旋轉(zhuǎn)信號，打開HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域的路徑，激活剪刀。然后Cas9的這種活性構(gòu)象能夠切割靶DNA的兩條鏈。

Chen，Dagdas和Kleinstiver隨后表明，通過突變部分REC3，可以改變Cas9蛋白的特異性，使HNH核酸酶不被激活，除非引導(dǎo)RNA和靶DNA匹配非常接近。他們能夠設(shè)計出一種改進的超精確Cas9，被稱為HypaCas9，它保留了其目標效率，但在區(qū)分人類細胞中的目標和非目標位點方面略勝一籌。

“如果你突變REC3中的某些氨基酸殘基，你可以調(diào)整Cas9靶向活性和改善特異性之間的平衡;我們能夠找到在目標靶標上有足夠活性的甜點，但也可以大幅減少 - 目標事件，“陳說。

通過繼續(xù)探索Cas9的結(jié)構(gòu)，功能和動力學(xué)之間的關(guān)系，Doudna和她的團隊希望進一步設(shè)計具有精確靈敏度的蛋白質(zhì)，以可靠和有效地進行各種遺傳改變。