CRISPR-Cas9基因編輯基于為保護(hù)自身免受病毒侵害而開發(fā)的策略細(xì)菌?，F(xiàn)在的研究表明，抗衡病毒產(chǎn)生的抗抑制蛋白被稱為抗CRISPRs，可用于改進(jìn)CRISPR-Cas9作為基因治療工具，減少可能引起不良副作用的脫靶基因編輯。

本周在“科學(xué)進(jìn)展”雜志網(wǎng)絡(luò)版上發(fā)表的一項(xiàng)研究表明，加州大學(xué)伯克利分校和加州大學(xué)舊金山分校的研究人員表示，最近發(fā)現(xiàn)的抗CRISPR蛋白質(zhì)可以將脫靶效應(yīng)降低四倍，就像殺死開關(guān)一樣CRISPR-Cas9完成其工作后。

該研究表明，一種名為AcrIIA4的特異性抗CRISPR蛋白質(zhì)降低了CRISPR-Cas9分子的脫靶效應(yīng)的四倍，該分子使用指導(dǎo)RNA來(lái)發(fā)現(xiàn)，剪切和替換導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞病的突變血紅蛋白基因。它沒有顯著減少所需的目標(biāo)基因編輯。

“由于脫靶基因編輯，可能會(huì)出現(xiàn)意想不到的突變，但我們的論文與許多其他人一樣 - 表明可以調(diào)節(jié)脫靶效應(yīng)，并且不像人們想象的那么嚴(yán)重，”加州大學(xué)伯克利分校博士后研究員Jiyung說(shuō)。 Jenny Shin，來(lái)自Innovative Genomics Institute的Jacob Corn實(shí)驗(yàn)室，也是該論文的三位首批作者之一。

在她對(duì)人體細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，Shin發(fā)現(xiàn)交付CRISPR-Cas9然后幾小時(shí)后，抗??CRISPR蛋白，是減少脫靶效應(yīng)的最有效方法。蛋白質(zhì)模仿DNA，在Cas9上閃爍，Cas9是實(shí)際切割雙鏈DNA的酶，可防止進(jìn)一步切割。

“即使經(jīng)過(guò)6個(gè)小時(shí)的有效CRISPR，插入抗-TCR將目標(biāo)效應(yīng)降低兩倍以上，與目標(biāo)效應(yīng)相比，”Shin說(shuō)。“治療上，你可以先用CRISPR治療患者，然后再用抗CRISPR治療，減少脫靶效應(yīng)。”

發(fā)現(xiàn)AcrIIA4的研究員，加州大學(xué)舊金山分校的Joseph Bondy-Denomy預(yù)測(cè)這些抗CRISPR蛋白質(zhì)成為CRISPR基因治療的標(biāo)準(zhǔn)部分，與CRISPR-Cas9一起在固定的一段時(shí)間后禁用基因編輯以防止隨機(jī)關(guān)閉 - 切割目標(biāo)。

“這種Cas9抑制劑可以編碼在與Cas9相同的DNA上，例如，精確定時(shí)在基因編輯完成后關(guān)閉Cas9，而不是讓Cas9在細(xì)胞中停留并冒著脫靶效應(yīng)，”Bondy說(shuō)。 -Denomy，也是該論文的共同作者。

抗CRISPR結(jié)合

該團(tuán)隊(duì)包括了CRISPR-Cas9基因編輯發(fā)明人之一Jennifer Doudna實(shí)驗(yàn)室的研究人員，他們確定了抗CRISPR蛋白如何與CRISPR-Cas9復(fù)合物結(jié)合。使用低溫電子顯微鏡，他們發(fā)現(xiàn)抗CRISPR基本上模仿DNA，誘使CRISPR-Cas9與其結(jié)合，然后永不放棄。

CRISPR抑制劑靶向Cas9蛋白上的一個(gè)斑點(diǎn)，這對(duì)Cas9的功能至關(guān)重要，當(dāng)它被抗CRISPR結(jié)合時(shí)，它不能用于切割DNA。

去年，Bondy-Denomy報(bào)道發(fā)現(xiàn)四種抗CRISPR蛋白被攻擊病毒用于滅活細(xì)菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中發(fā)現(xiàn)的Cas9蛋白的版本。其中兩種也抑制了研究人員最常使用的Cas9蛋白，后者改編自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，被稱為SpyCas9。另一個(gè)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了另外三種抗CRISPR蛋白，這些蛋白可以對(duì)抗一種不同但有前景的Cas9蛋白，這種蛋白適用于腦膜炎奈瑟氏球菌。

目前的研究觀察了來(lái)自李斯特菌的一種蛋白質(zhì)AcrIIA4對(duì)裝載有導(dǎo)向RNA的SpyCas9的影響，所述導(dǎo)向RNA包含在互補(bǔ)DNA上以進(jìn)行結(jié)合和切割。

加州大學(xué)伯克利分校和其他地方的研究表明，CRISPR-Cas9不斷對(duì)細(xì)胞DNA修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行研究：隨著酶在其靶位點(diǎn)切割，細(xì)胞修復(fù)DNA，CRISPR-Cas9再次切割，重復(fù)這種惡性循環(huán)直至出現(xiàn)突變?cè)诜乐姑附Y(jié)合的DNA中，此時(shí)CRISPR-Cas9分子繼續(xù)移動(dòng)以找到另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

目前來(lái)自Corn和Doudna實(shí)驗(yàn)室的工作表明，在Cas9成功編輯靶基因后添加抗CRISPR可以防止對(duì)基因組其他部分的意外損害。

“將Cas9基因編輯關(guān)閉的能力與開啟它的能力同樣重要，”IGI生物醫(yī)學(xué)科學(xué)主任，加州大學(xué)伯克利分校和分子與細(xì)胞生物學(xué)輔助教授兼玉說(shuō)。“想象一下，如果你的電動(dòng)剃須刀沒有開關(guān)!對(duì)于最終的治療應(yīng)用，能夠精確控制基因編輯活動(dòng)的時(shí)間和地點(diǎn)至關(guān)重要?？笴RISPR蛋白質(zhì)提供了完全關(guān)閉Cas9的機(jī)會(huì)。微調(diào)它的活動(dòng)。“

“Jenny的數(shù)據(jù)表明，有一個(gè)理想的時(shí)間窗口可讓Cas9完成工作，然后在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后將其關(guān)閉，”Bondy-Denomy說(shuō)。“我們實(shí)際上可以使用抗CRISPR蛋白質(zhì)作為工具來(lái)確定那個(gè)時(shí)間窗口是什么，也就是說(shuō)，對(duì)于任何一種具有任何一種指導(dǎo)RNA序列的細(xì)胞類型，我們希望Cas9在細(xì)胞中活躍多久。”