CRISPR Toolbox獲得增強(qiáng)的Cas12a用于基因組編輯

CRISPR工具箱不斷發(fā)展，特別是在可用于基因編輯的Cas酶的擴(kuò)增中。新Cas酶的發(fā)現(xiàn)和先前已知的Cas酶的增強(qiáng)都增加了可用核酸酶的所有組成部分。本周，來自馬薩諸塞州綜合醫(yī)院(MGH)的一組研究人員發(fā)表了一種增強(qiáng)的CRISPR-Cas12a酶變體，該酶增加了活性并改善了基因和表觀遺傳編輯的靶向范圍。

該論文“ Engineered CRISPR-Cas12a變體具有增加的活性和改進(jìn)的基因，表觀遺傳和堿基編輯的靶向范圍 ”發(fā)表在Nature Biotechnology上。

Cas12a(以前稱為Cpf1)核酸酶在多種基因編輯應(yīng)用中顯示出前景，但是，對于更長的原型間隔相鄰基序(PAM) - 特別是形式為5'-TTTV(其中V是A，C，或G.)這種特殊的限定條件相對于常用的化膿性鏈球菌 Cas9(SpCas9)約為6倍。

來自Keith Joung，MD，PhD實驗室的小組使用結(jié)構(gòu)引導(dǎo)蛋白質(zhì)工程來創(chuàng)建Acidaminococcus sp的變體。Cas12a具有擴(kuò)展的PAM識別配置文件。研究小組創(chuàng)建了“10個帶有單個氨基酸取代的變體，帶有正電荷的精氨酸殘基，可能會改變或形成新的PAM近端DNA接觸。”根據(jù)他們的研究結(jié)果，該團(tuán)隊選擇一個具有最大擴(kuò)展PAM靶向范圍的三重突變體，被稱為增強(qiáng)型AsCas12a(enAsCas12a。)。與野生型相比，該變體顯示出顯著擴(kuò)大的靶向范圍，能夠靶向許多以前難以接近的PAM，并且在具有規(guī)范TTTV PAM的位點上平均高出兩倍的基因組編輯活性。

“這些綜合增強(qiáng)功能使enAsCas12a成為迄今為止最活躍和可靶向的Cas12a酶，”第一作者Ben Kleinstiver博士指出，他是Joung實驗室的前博士，目前在MGH的基因組醫(yī)學(xué)中心擁有自己的研究小組。

Kleinstiver告訴 GEN ，“enAsCas12a通過與野生型Cas12a相比改善靶向范圍~7-8倍，并通過將靶活性提高約2-3倍來解決Cas12a的一些局限性; 這些改進(jìn)共同使Cas12a平臺在這些屬性上與SpCas9更具可比性。“

“我們還發(fā)現(xiàn)與enAsCas12a相關(guān)的改善轉(zhuǎn)化為原代人類T細(xì)胞，我們展示了更有效的編輯(與野生型AsCas12a相比再次改善2-3倍)和enAsCas12a有效靶向以前無法接近的位點的能力對于Cas12a酶，“Kleinstiver說。

本報告緊接著其他兩份報道新Cas酶的出版物。1月下旬，MIT的神經(jīng)科學(xué)教授，共同發(fā)現(xiàn)者Feng Zhang博士的一份報告報道了一種新設(shè)計的Cas12b酶，其功能增強(qiáng)。由于Cas12b的溫度限制是酶在生理相關(guān)條件下的實用性的重大障礙，因此增強(qiáng)是一項重要的進(jìn)步。同樣，加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna博士的實驗室最近揭示了一個先前未被描述的，基本上不同的基因組編輯平臺CasX的潛在機(jī)制。。所有三種酶家族(Cas12a，Cas12b和CasX(Cas12e)都具有略微不同的特性。為此，Kleinstiver指出“它們”很可能各有其優(yōu)勢。“

在特定情況下，一個Cas不僅可能比另一個更適用，而且，工具箱中的更多工具對于同時執(zhí)行多個基因組編輯任務(wù)的研究人員特別有用。例如，對于那些想要與表觀基因組和基因調(diào)控修飾同時編輯DNA的人來說，越多越好。

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