礦化由成骨細(xì)胞介導(dǎo)，成骨細(xì)胞通過基質(zhì)囊泡(MV)分泌礦物質(zhì)前體，作為脊椎動物的基本過程。囊泡富含鈣和磷酸鹽，含有有機(jī)物質(zhì)，如酸性蛋白質(zhì)。現(xiàn)在發(fā)表在Science Advances上的一項新研究，Tomoaki Iwayama及其同事在牙周病學(xué)，生物醫(yī)學(xué)研究，口腔科學(xué)，生物材料和口腔解剖學(xué)發(fā)展部門使用掃描電子輔助介電顯微鏡(SE-ADM)和超分辨率顯微鏡(SRM)來評估礦化條件下的活體成骨細(xì)胞納米級分辨率。他們發(fā)現(xiàn)含鈣囊泡是含有礦化納米囊泡或基質(zhì)囊泡(MVs)的多囊體。根據(jù)觀察結(jié)果，MV可以與溶酶體一起運輸并通過胞吐作用分泌。Iwayama等。提供了溶酶體可以在礦化成骨細(xì)胞中運輸無定形磷酸鈣的證據(jù)。

在骨礦化的生理過程中，磷酸鈣晶體的沉積在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)生，作為所有脊椎動物的基本過程。1967年，生物學(xué)家Clarke Anderson和Ermanno Bonucci使用電子顯微鏡(EM)分別在細(xì)胞外空間中可視化礦物相關(guān)顆粒?？茖W(xué)家后來將這些顆粒識別為礦化納米囊泡或基質(zhì)囊泡(MVs)。在過去50年的MV研究中，生物學(xué)家一直在努力了解MV形成和分泌的機(jī)制，這在很大程度上仍然未知。

用EM 澄清活細(xì)胞的礦化過程是具有挑戰(zhàn)性的，因為EM的樣品制備需要化學(xué)固定和酒精脫水兩個步驟。這些步驟可誘導(dǎo)人工制品，甚至溶解或除去不穩(wěn)定的礦物前體，留下稱為“ 晶體鬼 ” 的有機(jī)支架。雖然科學(xué)家成功地使用固定和脫水組織的EM過程來觀察骨中礦化膠原纖維的結(jié)構(gòu)，研究礦物質(zhì)前體，但他們必須采用低溫EM工藝來避免脫水，并且使用小標(biāo)本進(jìn)行昂貴，極快的冷卻。

為了克服目前工作中的這些局限性，Iwayama等人。使用了一種稱為掃描電子輔助介電顯微鏡(SE-ADM)的新型微觀系統(tǒng)。該方法先前已經(jīng)在水性介質(zhì)中對哺乳動物細(xì)胞實現(xiàn)了納米級分辨率和高對比度成像而沒有染色?？茖W(xué)家使用相同的技術(shù)(高分辨率SE-ADM)探索在完整成骨細(xì)胞中觀察MV的可能性，以了解 MV販運的生物發(fā)生。對于成骨細(xì)胞系，他們使用鼠(小鼠)成骨細(xì)胞系KUSA-A1，在體外和體內(nèi)具有高成骨能力。在充分條件下細(xì)胞培養(yǎng)后，Iwayama等。用SE-ADM觀察細(xì)胞以鑒定正常的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)?？茖W(xué)家們觀察到MVs 在成骨培養(yǎng)基中細(xì)胞生長4到10天后與膠原原纖維排列，并且由于融合或顆粒生長，分泌的粒徑增加，其大小與之前的報告一致，表明它們確實是MV。

在用SE-ADM進(jìn)一步檢查后，他們注意到溶酶體途徑涉及以與外來體類似的過程轉(zhuǎn)運和分泌腔內(nèi)MV。有趣的是，外泌體和MV都被歸類為具有相似大小的細(xì)胞外囊泡; 它們均由成骨細(xì)胞分泌，并在細(xì)胞間通訊中具有共同的功能。

在下一步，Iwayama等。檢查這些顆粒是否是含有鈣和/或磷酸鹽的MV。為此，他們將細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，并使用SE-ADM觀察它們以記錄非晶面結(jié)構(gòu)，沒有晶面。這表明MVs沒有結(jié)晶，但仍然是無定形的，這也是先前研究中記錄的。當(dāng)科學(xué)家在SiN(硅氮化硅)薄膜上檢測MV時，他們觀察到對應(yīng)于磷，鈣，碳和氧元素的尖峰。他們使用拉曼光譜證實了這一發(fā)現(xiàn)，以證明MVs中存在磷酸鈣。

科學(xué)家們還研究了由磷脂酶(堿性磷酸酶)基因編碼的醫(yī)學(xué)病癥的低磷酸鹽血癥的影響，其中成骨細(xì)胞在體外不會發(fā)生礦化。為此，他們使用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)編輯成骨細(xì)胞的基因組以產(chǎn)生Alp1敲除的成骨細(xì)胞克隆。當(dāng)Iwayama等人。使用高分辨率SE-ADM檢測敲除克隆，他們沒有觀察到MV，由于沒有磷和鈣峰，使用光譜分析進(jìn)一步證實了MV。

在使用SE-ADM直接觀察MV的產(chǎn)生和分泌后，科學(xué)家們進(jìn)一步研究了溶酶體參與MV的細(xì)胞內(nèi)運輸以觀察活體成骨細(xì)胞礦化。他們在含鈣成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并用LysoTracker染色，以檢測感興趣的細(xì)胞內(nèi)組分。Iwayama等。找到與溶酶體相匹配的鈣黃綠素囊泡，以表明與鈣黃綠素+囊泡融合后溶酶體內(nèi)MV的生物發(fā)生?？茖W(xué)家們在實驗中進(jìn)行了功能喪失和功能抑制研究，以進(jìn)一步解構(gòu)這些途徑并檢測體外活細(xì)胞礦化過程中的細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制。

科學(xué)家此前曾報道過，由于成骨細(xì)胞線粒體中存在電子致密的富含鈣和磷的顆粒，線粒體在礦化過程中受累。用改進(jìn)的冷凍技術(shù)觀察到這一點。此外，報告還表明溶酶體和線粒體的直接接觸具有功能意義。當(dāng)Iwayama等人。用LysoTracker和MitoTracker染色細(xì)胞并在N-SIM結(jié)構(gòu)照明超分辨率顯微鏡(SRM)下觀察細(xì)胞內(nèi)組分。他們觀察到線粒體旁邊存在大多數(shù)符合鈣黃綠素的囊泡，并與溶酶體相匹配。在SRM時間推移成像期間，科學(xué)家們進(jìn)一步獲得了LysoTracker的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運觀點，其中含有與線粒體相鄰的靜態(tài)鈣黃綠液泡融合的囊泡，以驗證其假設(shè)。

通過這種方式，結(jié)合對其他SRM系統(tǒng)和其他細(xì)胞系的觀察，Tomoaki Iwayama及其同事提出了一種礦化機(jī)制。其中溶酶體在細(xì)胞內(nèi)MV生物發(fā)生和成骨細(xì)胞內(nèi)的運輸中起重要作用。將溶酶體用于成骨細(xì)胞以運輸無定形磷酸鈣而在其在胞質(zhì)溶膠中轉(zhuǎn)運期間沒有結(jié)晶是合理的。該科學(xué)家旨在進(jìn)行進(jìn)一步的實驗以了解MV的調(diào)節(jié)分子，并研究MV和外泌體是否具有與其產(chǎn)生，分泌和功能相似的相似構(gòu)成和機(jī)制。本工作中使用的SE-ADM策略可以低成本安裝到現(xiàn)有的掃描電子顯微鏡設(shè)備中。該研究開發(fā)的工作將提供適用于所有科學(xué)領(lǐng)域的納米級非侵入性，高分辨率成像。