研究人員揭示了由胞嘧啶堿基編輯引起的意外全基因組脫靶突變

中國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)胞嘧啶堿基編輯器(BE3和HF1-BE3)誘導(dǎo)全基因組脫靶突變。由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組利用水稻全基因組測序(WGS)對BE3，HF1-BE3和ABE 的脫靶突變進行了全面調(diào)查。，一種重要的作物品種。

單核苷酸改變是人類疾病和經(jīng)濟生物中性狀變異的重要原因。核堿基編碼器對單核苷酸多態(tài)性的基因工程為基因治療帶來了巨大希望，它可以潛在地治愈人類疾病并改善作物植物的性狀。

研究人員已經(jīng)開發(fā)出胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器(分別是CBE和ABE)?；A(chǔ)編輯器是切口酶型Cas9蛋白與胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶的融合，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)催化單個指導(dǎo)RNA(sgRNA)的靶位點中C> T或A> G的轉(zhuǎn)化。。

盡管CBE和ABE的靶向轉(zhuǎn)化在許多生物體中發(fā)現(xiàn)，但它們的脫靶效應(yīng)尚未在全基因組水平上進行系統(tǒng)評估。

基礎(chǔ)編輯特異性的過去分析主要局限于使用計算機軟件預(yù)測的類似靶標(biāo)的位點。這些類似靶標(biāo)的位點通常數(shù)量少并且基因組分布受限。

考慮到大腸桿菌，酵母細(xì)胞和人類細(xì)胞中胞嘧啶脫氨酶的異位表達(dá)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)引發(fā)全基因組脫氨基因事件，在全基因組水平和檢測基因編輯器的特異性已經(jīng)變得必要和迫切。無偏見的方式。

研究人員選擇了三種廣泛使用的基礎(chǔ)編輯器：BE3，高保真BE3(HF1-BE3)和ABE。將靶向11個基因組位點的總共14個堿基編輯構(gòu)建體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化到水稻中。

由BE3，HF1-BE3或ABE編輯的再生T0植物和用基礎(chǔ)編輯但沒有sgRNA轉(zhuǎn)化的植物，以及兩個對照組的植物(即野生型水稻和轉(zhuǎn)基因水稻的無效分離株)，由WGS分析。

基礎(chǔ)編輯器組和控制組在找到的插入數(shù)量上沒有顯著差異。相反，BE3和HF1-BE3組具有比ABE和對照組顯著更多的單核苷酸變體(SNV)。

每株植物的C> T單核苷酸變體(SNV)的平均數(shù)為：203(BE3); 347(HF1-BE3); 88(ABE); 和105(對照組)。因此，BE3和HF1-BE3植物中的C> T SNV分別比對照植物高94.5%和231.9%。

值得注意的是，在沒有sgRNA的情況下用BE3和HF1-BE3處理水稻植物也導(dǎo)致大量的C> T SNV。此外，由BE3和HF1-BE3賦予的絕大多數(shù)額外C> T突變與使用計算機軟件(Cas-OFFinder)預(yù)測的脫靶位點不匹配。

發(fā)現(xiàn)所有SNV以及C> T SNV分布在整個水稻基因組中，表明全基因組發(fā)生。用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作圖顯示，與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域相比，與BE3和HF1-BE3相關(guān)的大量C> T SNV更頻繁地發(fā)生，其中由于活性轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生單鏈DNA。

總而言之，高博士團隊生成的數(shù)據(jù)表明，BE3和HF1-BE3(而非ABE)在水稻中誘導(dǎo)全基因組脫靶突變。這些脫靶突變，主要是C> T SNV并且在轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域中富集，不是通過當(dāng)前的計算機方法預(yù)測的。含有胞嘧啶脫氨酶的堿基轉(zhuǎn)化單元可能是BE3和HF1-BE3引發(fā)的大量脫靶SNV的原因，需要進行優(yōu)化以提高胞嘧啶堿基編輯的特異性。

“基因編輯器代表了一種吸引人的工具，用于產(chǎn)生植物育種所需的精確遺傳變異。這些編輯的特異性至關(guān)重要，因為脫靶突變可能是有害的。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)前的BE3或HF1-BE3導(dǎo)致意外和不可預(yù)測的基因組植物中廣泛的脫靶突變，凸顯了優(yōu)化這類編輯特異性的緊迫性，“高博士說。

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