基因組編輯在小鼠細(xì)胞中進(jìn)行高效的CRISPR實(shí)驗(yàn)

為了使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)切割基因，研究人員必須設(shè)計(jì)一個(gè)與靶基因DNA相匹配的RNA序列。大多數(shù)基因具有數(shù)百個(gè)這樣的序列，在基因組中具有不同的活性和獨(dú)特性。因此，手工難以實(shí)現(xiàn)對最佳序列的搜索。新的“CrispRGold”計(jì)劃幫助科學(xué)家確定最有效和特異的RNA序列。它是由亥姆霍茲聯(lián)合會(MDC)MaxDeldelbrück分子醫(yī)學(xué)中心的Klaus Rajewsky教授領(lǐng)導(dǎo)的一組研究人員設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在在PNAS期刊中有描述。。該團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了一種新的小鼠模型，該模型已攜帶Cas9蛋白。將該小鼠模型與可靠的RNA序列組合使得原代細(xì)胞中的基因有效失活。這使研究人員能夠發(fā)現(xiàn)參與免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的新基因。

對于許多分子生物學(xué)家來說，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著研究的一個(gè)新的里程碑：最后，基因組DNA可以高效率和高精度地切割，使基因能夠被禁用，修飾或重新引入。這僅需要來自遺傳物質(zhì)的RNA片段，其將Cas9蛋白質(zhì)剪刀帶到待切割的DNA中的點(diǎn)。這個(gè)RNA片段，稱為sgRNA(單指導(dǎo)RNA)，含有20個(gè)與基因組靶位點(diǎn)互補(bǔ)的RNA字母序列，科學(xué)家們迄今必須通過手工或各種在線工具進(jìn)行費(fèi)力的選擇。在某些情況下，當(dāng)時(shí)不確定sgRNA是否會將Cas9基因剪刀帶到正確的位置或基因組中相似但不需要的位置以及sgRNA效率是否高。

由Klaus Rajewsky教授領(lǐng)導(dǎo)的MDC研究小組的博士生Robin Graf撰寫的新“CrispRGold”計(jì)劃使得禁用特定基因變得更加容易。

該程序搜索確定的DNA靶序列以鑒定切割的最佳位置，并提示遺傳物質(zhì)中獨(dú)特的sgRNA序列，因此僅將Cas9蛋白遞送至所需的點(diǎn)。然后，Cas9可以剪斷基因，使其停止運(yùn)作。該算法基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及序列的唯一性和其他性質(zhì)。

與他的同事Van Trung Chu博士一起，Graf在某些白細(xì)胞上測試了該系統(tǒng)在小鼠中，B細(xì)胞。這些細(xì)胞不能長時(shí)間培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈儾荒茉谧匀画h(huán)境之外存活很長時(shí)間。因此，必須在盡可能多的細(xì)胞中快速停用基因以研究它們的功能。Chu通過培育遺傳修飾的小鼠系列來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，這些小鼠產(chǎn)生大量但耐受良好的Cas9基因剪刀。研究人員隨后從這些小鼠中分離出B細(xì)胞，并將針對個(gè)體基因特異性的sgRNA傳遞給這些細(xì)胞。格拉夫表示，具有高重現(xiàn)性，使用CrispRGold設(shè)計(jì)的sgRNA在平均80%的細(xì)胞中破壞了目標(biāo)基因 - “這是一個(gè)很好的比率”。“在這種低通量實(shí)驗(yàn)中，高效率和低錯(cuò)誤率是絕對必要的。”

研究人員使用他們的新方法來鑒定許多以前未知的參與B細(xì)胞發(fā)育的基因。CrispRGold計(jì)劃現(xiàn)在將在線提供，以供全球科學(xué)家使用：“該計(jì)劃可以很容易地用于來自各種生物體的其他類型的細(xì)胞。它也可能與臨床應(yīng)用相關(guān) - 它處理序列作為一項(xiàng)高度優(yōu)先的獨(dú)特性，從而最大限度地降低了可能不必要的基因修飾的風(fēng)險(xiǎn)，這必須在基因治療中不惜一切代價(jià)，“格拉夫說。CrispRGold預(yù)計(jì)將于2016年11月在http://crisprgold.mdc-berlin.de上發(fā)布。

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