名古屋大學(xué)轉(zhuǎn)化生物分子研究所(ITbM)的一對植物生物學(xué)家在植物和細(xì)胞生理學(xué)雜志上報(bào)道了開發(fā)新載體(轉(zhuǎn)移遺傳信息的載體)以敲除靶基因在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，以高效和可遺傳的方式?；蚪M由生物體的完整DNA組成，包括其基因，其中包含開發(fā)和維持生物體所需的所有信息?；蚪M工程涉及通過去除，添加和改變DNA序列的部分對基因組部分進(jìn)行特異性修飾，是一種快速發(fā)展的技術(shù)。到目前為止，CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/ Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)系統(tǒng)是其最簡單，通用性和效率最常用的遺傳操作方法之一。

盡管如此，迄今為止，誘導(dǎo)CRISPR / Cas9對模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)的效率的突變?nèi)匀挥行┑?。這是因?yàn)榛蛲蛔兊挠|發(fā)因素在細(xì)胞的后期發(fā)育階段被激活。因此，需要大量的時(shí)間，努力和植物物種來獲得具有敲除的靶基因的所需植物物種。

CRISPR / Cas9由2個(gè)關(guān)鍵分子組成，一片稱為引導(dǎo)RNA(gRNA)的RNA和一種名為Cas9的酶。Cas9充當(dāng)分子剪刀，可以切割基因組中特定位置的DNA上的兩條鏈，從而可以在該位置添加或去除DNA序列。另一方面，gRNA由預(yù)先設(shè)計(jì)的RNA序列(約20個(gè)堿基長)組成，其位于較長的RNA支架內(nèi)。RNA支架與DNA結(jié)合，預(yù)先設(shè)計(jì)的RNA序列將Cas9蛋白引導(dǎo)至基因組的特定部分，因此Cas9可以在目標(biāo)位置切割。

“通過使用從植物細(xì)胞早期胚胎期表達(dá)的RIBOSOMAL PROTEIN S5A(RPS5A)基因的啟動子，我們能夠誘導(dǎo)Cas9蛋白高效敲除卵細(xì)胞中的基因，”Hiroki Tsutsui說，這項(xiàng)研究的第一作者。“這種RPS5A啟動子在卵細(xì)胞中具有活性，我們決定將這種分子工具稱為pKAMA-ITACHI Red(pKIR)載體，它可以相對于植物中常用的35S啟動子高效編輯植物的基因組，”他繼續(xù)說道。 。

'Kama-itachi'具有三種類似黃鼠狼的生物的日本含義，其中第一只黃鼠狼瞄準(zhǔn)并絆倒一個(gè)人，其次是第二只黃蜂通過切割它來傷害這個(gè)人，第三只用來治愈這個(gè)人。這類似于CRISPR / Cas9系統(tǒng)對DNA的過程，其中CRISPR靶標(biāo)，Cas9切割，并誘導(dǎo)感興趣的特定DNA序列的修復(fù)。

“通過能夠有效地敲除擬南芥中的靶基因，我們認(rèn)為這是闡明植物遺傳功能的有前景的方法，”該研究的教授和領(lǐng)導(dǎo)者Tetsuya Higashiyama說。“我們希望我們可以將這種方法應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜等作物的基因組編輯，以加速其生長并產(chǎn)生多種植物系。”

CRISPR / Cas9系統(tǒng)通過敲除特定基因來研究它們的功能。在模型植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，由于Cas9蛋白在細(xì)胞的后期發(fā)育階段表達(dá)，基因敲除的程度根據(jù)組織而變化。因此基因組突變效率相對較低。

例如，當(dāng)使用常用的植物35S啟動子在擬南芥中表達(dá)Cas9蛋白時(shí)，盡管在葉中觀察到基因的頻繁敲除，但在花中僅檢測到少數(shù)。這表明靶基因的敲除突變效率在花的生殖細(xì)胞中相對較低。隨后，敲除突變難以傳遞給下一代的子細(xì)胞。

“通過能夠有效地敲除擬南芥中的靶基因，我們認(rèn)為這是闡明植物遺傳功能的有前景的方法，”該研究的教授和領(lǐng)導(dǎo)者Tetsuya Higashiyama說。“我們希望我們可以將這種方法應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜等作物的基因組編輯，以加速其生長并產(chǎn)生多種植物系。”

CRISPR / Cas9系統(tǒng)通過敲除特定基因來研究它們的功能。在模型植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，由于Cas9蛋白在細(xì)胞的后期發(fā)育階段表達(dá)，基因敲除的程度根據(jù)組織而變化。因此基因組突變效率相對較低。

例如，當(dāng)使用常用的植物35S啟動子在擬南芥中表達(dá)Cas9蛋白時(shí)，盡管在葉中觀察到基因的頻繁敲除，但在花中僅檢測到少數(shù)。這表明靶基因的敲除突變效率在花的生殖細(xì)胞中相對較低。隨后，敲除突變難以傳遞給下一代的子細(xì)胞。

為了解決這個(gè)問題，Higashiyama的小組決定在早期發(fā)育階段在卵細(xì)胞和細(xì)胞中表達(dá)Cas9蛋白，以提高基因的敲除效率。

“由于卵細(xì)胞和受精卵細(xì)胞(受精卵)是植物細(xì)胞發(fā)育和生長的起源，我們認(rèn)為如果在早期階段進(jìn)行基因組編輯，基因突變可能會高效率地發(fā)生，并且可以被下一代遺傳。細(xì)胞的生成，“Tsutsui解釋說。“pKIR載體是理想的，因?yàn)樗梢栽诼鸭?xì)胞期和發(fā)育階段連續(xù)表達(dá)Cas9蛋白。”

該團(tuán)隊(duì)首先嘗試敲除PDS3(Phytoene DeSaturase 3)基因，該基因已知是植物中葉綠素合成的原因。沒有葉綠素，植物將成為具有白色外觀的白化物種。通過用pKIR表達(dá)Cas9，Tsutsui成功觀察到PDS3基因的敲除，表現(xiàn)為白化植物的產(chǎn)生。

Tsutsui還研究了當(dāng)PDS3基因被敲除時(shí)對花莖中合成的葉綠素量的影響。在使用35S啟動子表達(dá)Cas9時(shí)，葉綠素的量僅與野生型中觀察到的量略有不同。另一方面，當(dāng)通過pKIR誘導(dǎo)Cas9時(shí)，葉綠素的量急劇下降，表明基因的敲除已經(jīng)有效地發(fā)生。

該小組還發(fā)現(xiàn)，pKIR載體成功擊倒在擬南芥中的其他基因，如AGAMOUS(AG)，DUO1(DUO花粉1)，和ADH1(醇脫氫酶1)，其參與了花，精子的發(fā)展細(xì)胞和分別將醇轉(zhuǎn)化為醛的酶。

AGAMOUS是參與花發(fā)育(花分生組織)的轉(zhuǎn)錄因子。在敲除由pKIR誘導(dǎo)的AGAMOUS基因后，觀察到花中的花，稱為雙花，其頻率高。另外，在由pKIR誘導(dǎo)的編碼雄性生殖系的DUO1基因的敲除實(shí)驗(yàn)中，生殖細(xì)胞的細(xì)胞分裂受損并且觀察到不能生育的精子樣細(xì)胞。

編碼將烯丙醇轉(zhuǎn)化為丙烯醛(醛)的酶的ADH1基因也被高頻率的pKIR誘導(dǎo)敲除。這種高頻率表明ADH1基因在第一代的所有生殖細(xì)胞(卵細(xì)胞和精子細(xì)胞)中被敲除。具有ADH1基因敲除的突變體能夠存活，而野生型和雜合植物由于丙烯醛的產(chǎn)生而被殺死，丙烯醛對植物有毒。

“由于第二代中的所有物種都表現(xiàn)出相同的突變模式，這表明基因組編輯發(fā)生在發(fā)育階段的早期(第一代卵細(xì)胞中)，”Tsutsui說。

為了容易地鑒定安裝有CRISPR / Cas9基因的物種，含有Cas9的種子用紅色熒光標(biāo)記。

Tsutsui和Higashiyama已經(jīng)找到了一種有效的擬南芥基因組編輯方法，該方法包括用一種RPS5A啟動子(pKIR載體)表達(dá)Cas9，該啟動子可以在早期發(fā)育階段敲除細(xì)胞中的基因并誘導(dǎo)可以傳遞給細(xì)胞的突變。下一代的女兒細(xì)胞。

“這種pKIR方法可以讓我們研究可能具有重疊功能的基因簇，”Tsutsui說。“以前，我們必須通過交叉現(xiàn)有的突變體來檢測重疊的基因功能來制造多個(gè)敲除植物，這需要時(shí)間。我們應(yīng)該能夠通過我們相對低成本的方法快速獲取突變體來探索未鑒定的基因簇的功能。 “

“我們希望我們能夠繼續(xù)改進(jìn)這種方法，以提高突變效率，使其成為一種有用的基因組工程工具，用于修飾各種生物中的靶DNA序列，”Higashiyama說。