抽象

隨著人類基因組序列的完成，注意力轉向識別和注釋其功能性DNA元件。作為遺傳和比較基因組學方法的補充，啟動了DNA元素項目百科全書，以提供許多細胞類型中RNA轉錄物，轉錄調(diào)節(jié)因子結合位點和染色質狀態(tài)的圖譜。得到的全基因組數(shù)據(jù)揭示了具有高位置分辨率和細胞類型特異性的生化活性位點，這有助于研究基因調(diào)控和與人類疾病相關的非編碼變體的解釋。然而，生物化學活性區(qū)域覆蓋了比進化保守區(qū)域大得多的基因組，提出了非保守但生物化學活性區(qū)域是否真正起作用的問題。這里，我們回顧了用于定義功能性DNA片段的生化，進化和遺傳方法的優(yōu)勢和局限性，觀察到的估計基因組覆蓋率差異的潛在來源以及這些差異的生物學意義。我們還分析了信號強度，基因組覆蓋率和進化保護之間的關系。我們的結果強化了每種方法提供補充信息的原則，并且我們需要使用所有三種方法的組合來闡明人類生物學和疾病中的基因組功能。我們還分析了信號強度，基因組覆蓋率和進化保護之間的關系。我們的結果強化了每種方法提供補充信息的原則，并且我們需要使用所有三種方法的組合來闡明人類生物學和疾病中的基因組功能。我們還分析了信號強度，基因組覆蓋率和進化保護之間的關系。我們的結果強化了每種方法提供補充信息的原則，并且我們需要使用所有三種方法的組合來闡明人類生物學和疾病中的基因組功能。

尋求識別人類基因組中的功能元素

完成人類基因組參考序列是現(xiàn)代生物學的里程碑。剩下的相當大的挑戰(zhàn)是確定和描繪所有基因和其他功能元素的結構。很快就認識到，構成人類基因組的約33億個核苷酸中有近99%不編碼蛋白質(1)。比較基因組學的研究顯示，大多數(shù)的哺乳動物保守和最近適于區(qū)域由非編碼元件(2 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 10)。最近，全基因組關聯(lián)研究表明，大多數(shù)性狀相關的基因座，包括那些有助于人類疾病和敏感性的，也位于外蛋白質編碼區(qū)(11 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 16)。這些發(fā)現(xiàn)表明，人類基因組的非編碼區(qū)域具有豐富的功能重要元件，具有不同的基因調(diào)控和其他功能。

盡管迫切需要識別和表征人類基因組中的所有功能元素，但重要的是要認識到對于什么構成功能沒有普遍的定義，也沒有就什么設定元素邊界達成一致?？茖W家和非科學家都有一個直觀的功能定義，但每個科學學科主要依賴于指示功能的不同證據(jù)。遺傳學家，進化生物學家和分子生物學家應用不同的方法，評估不同的和互補的證據(jù)線。遺傳方法評估擾動的表型后果，進化方法量化選擇性約束，生化方法測量分子活動的證據(jù)。所有三種方法都可以提供基因組區(qū)段的生物相關性的高度信息，并且通過每種方法鑒定的元素組通常彼此定量地富集。然而，這些方法在它們預測的特定元素和每個人注釋的人類基因組的范圍方面差異很大

這些差異中的一些源于這樣的事實：生物化學和遺傳背景中的功能對細胞類型和條件非常特殊，而對于進化測量，功能是獨立于細胞狀態(tài)確定的，但取決于環(huán)境和進化生態(tài)位。這些方法在假陽性和假陰性率，元素定義的分辨率以及可以調(diào)查它們的吞吐量方面也存在很大差異。此外，每種方法仍然不完整，需要持續(xù)的方法開發(fā)(實驗和分析)和越來越大的數(shù)據(jù)集(其他物種，分析，細胞類型，變體和表型)。因此，這些方法在它們識別的特定元素方面差別很大，這并不奇怪。然而，

顯示為具有官能證據(jù)沖突的線元件的許多例子DNA元件(ENCODE)項目，包括具有保守的表型，但缺乏序列級保護(元件的百科全書之前被描述17 ⇓ ⇓ - 20，保守的無表型元件)上刪除(21，22)，和能夠驅動的組織特異性表達，但缺乏進化保守性(元件23，24)。然而，ENCODE項目生化活動調(diào)查(跨越更多細胞類型和分析)的規(guī)模導致基因組覆蓋率顯著增加，從而加劇了生化和進化估計之間的差異。這種差異導致了在科學文獻很多爭論都(25 。⇓ 。⇓ 。⇓ 。⇓ 。⇓ - 31)，并在網(wǎng)上論壇，從而重新需要澄清在人類基因組定義功能的挑戰(zhàn)，并認識差異的來源。

為了滿足這一需求并提供ENCODE科學家的觀點，我們審查了遺傳，進化和生物化學證據(jù)，討論了它們的優(yōu)勢和局限性，并研究了不同方法得出的結論之間的明顯差異。

遺傳方法。

遺傳方法依賴于序列改變來建立DNA片段的生物學相關性，通常被認為是定義功能的金標準。突變可以是天然存在的和通過篩選由序列產(chǎn)生表型鑒定變體(13，32)或通過定向遺傳方法(試制33)或非遺傳干擾(34)。在細胞系(使用報告基因測定轉染研究35，36)或胚胎(37)還可用于識別監(jiān)管要素并衡量其活動。遺傳方法往往通過適度的吞吐量的限制，雖然速度和效率現(xiàn)在正在增加對于一些方法(36，38 ⇓ - 40)。該方法還可能遺漏其表型僅出現(xiàn)在稀有細胞或特定環(huán)境背景中的元素，或者其效果太微妙而無法用當前測定法檢測。功能喪失測試也可以通過功能冗余來緩沖，使得表型后果需要雙重或三重中斷。與冗余，上下文或微妙功能一致，大型和高度保守的基因組片段的刪除有時沒有可辨別的生物體表型(21，22)，并且在被認為是必不可少的基因似乎衰弱突變在人群中(已發(fā)現(xiàn)41)。

進化方法。

比較基因組學提供了一種檢測非編碼功能元件的強大方法，這些功能元件在進化時間內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)先保守性。相關物種之間的高水平序列保守性指示純化選擇，由此排斥破壞性突變，相應的序列被認為可能是功能性的。功能的證據(jù)也可以來自物種之間或特定譜系內(nèi)的加速進化，揭示了最近獲得的增加適應性的變化的正選擇元素; 這種方法通過合并多個密切相關的基因組來獲得能力，因為每個物種提供有關序列約束的信息。多種類比較已被用于研究不同的進化枝，從酵母到哺乳動物。3，42 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 48)。比較基因組學方法還可以包含關于突變模式的信息，突變模式可以是不同類型元素的特征。

雖然功能強大，但進化方法也有局限性。保守區(qū)域的鑒定取決于準確的多物種序列比對，這仍然是一個重大挑戰(zhàn)。比對通常是用于遠端式作用調(diào)節(jié)區(qū)，在那里它們可通過調(diào)節(jié)基序周轉受到阻礙效果較差，改變間距的限制，和序列組成偏差(17，49)。分析對齊區(qū)域進行保護可能同樣具有挑戰(zhàn)性。首先，大多數(shù)轉錄因子結合序列是短的并且高度簡并，使得它們難以鑒定。其次，由于中性進化元素的檢測需要足夠的系統(tǒng)發(fā)育距離，該方法非常適合檢測哺乳動物保守元素，但對靈長類動物特異性元素效果較差，對人類特異性元素基本上是盲目的。第三，某些類型的功能元件如免疫基因即使在密切相關的物種中也可能易于快速進化轉換。更一般地，比對方法不適合捕獲保留功能的取代，例如保留RNA結構的補償性變化，在調(diào)節(jié)基序內(nèi)保留親和力的取代，或通過冗余或上位效應緩沖其效果的突變。因此，缺乏保護不能被解釋為缺乏功能的證據(jù)。

最后，盡管進化方法的優(yōu)點在于它不需要先驗知識DNA元素的作用或何時使用，但不太可能揭示選擇下的分子機制或相關的細胞類型或生理過程。因此，比較基因組學需要補充研究。

生化方法。

用于鑒定候選功能基因組元件的生物化學方法補充了其他方法，因為它特異于細胞類型，條件和分子過程?；蛘{(diào)控和RNA代謝的詳細研究的數(shù)十年來定義的功能的非編碼的元素，包括啟動子，增強子，沉默子，絕緣體和非編碼RNA基因如微RNA，了piRNA，結構的RNA，和調(diào)控RNA(的主要類別50 ⇓ ⇓ - 53)。這些非編碼功能元件與該顯示組蛋白修飾，DNA甲基化，DNA酶可訪問性，和轉錄因子占用(的簽名模式鮮明的染色質結構相關聯(lián)的37，54 ⇓ ⇓ ⇓⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 66)。例如，活性增強子通過特異性組蛋白修飾和DNase可接近的染色質標記，并且被序列特異性轉錄因子，共激活因子如EP300以及通常RNA聚合酶II占據(jù)。盡管個體特征對功能的貢獻程度仍有待確定，但它們?yōu)樽⑨尯蜻x增強子和其他類型的功能元件提供了有用的替代。

ENCODE報告正式成立，在高分辨率系統(tǒng)繪制人類基因組的功能元件，并提供此信息作為研究界(一個開放的資源目標67，68)。到目前為止，項目中的大多數(shù)數(shù)據(jù)采集采用了生物化學方法，利用作用于DNA片段的細胞或酶促過程的證據(jù)來幫助預測不同類別的功能元件。最近完成的ENCODE階段在全基因組范圍內(nèi)應用了廣泛的生化分析來研究多種人類細胞類型(69)。這些分析鑒定了基因組序列(i)，其中轉錄了核和細胞質的短和長RNA; (ii)由序列特異性轉錄因子，輔因子或染色質調(diào)節(jié)蛋白占據(jù); (iii)以可及的染色質組織; (iv)以DNA甲基化或特定組蛋白修飾為標志; (v)通過遠程染色體相互作用物理聚集在一起。

這種功能基因組學證據(jù)的一個優(yōu)點是它揭示了在給定細胞類型和活動狀態(tài)下每個位點涉及的生化過程。然而，生化簽名通常是功能的結果，而不是因果關系。它們也不總是確定性的功能證據(jù)，但可以隨機發(fā)生。例如，GATA1在某些紅細胞特異性增強子上的結合對功能至關重要，它占據(jù)了許多其他基因組位點缺乏可檢測的增強子活性或其他生物學功能證據(jù)(70)。同樣地，盡管增強劑強烈特性組蛋白修飾有關，這樣的修改的功能意義仍不清楚，和增強子狀簽名的單純的存在并不一定表示一個序列用作特定功能(71，72)。簡而言之，盡管生物化學特征對于在所檢查的細胞類型的生物學背景中鑒定候選調(diào)節(jié)元件是有價值的，但它們不能被解釋為其自身的功能的確定證據(jù)。