研究人員希望為廣泛的疾病開發(fā)疫苗，治療和新的診斷測試。要做到這一點(diǎn)，他們需要更好地了解一類關(guān)鍵的生物成分。被稱為表面膜蛋白，疾病過程中的這些重要成分形成了結(jié)構(gòu)和功能上多樣化的巨大復(fù)雜性組合。

在一項(xiàng)新的研究中，亞利桑那州立大學(xué)生物設(shè)計(jì)研究所的研究教授黛布拉漢森探索了一種研究由一對(duì)高致病性生物體產(chǎn)生的膜蛋白的創(chuàng)新方法。該研究小組表明，基于DNA的遺傳免疫，使用一種稱為基因槍的裝置，可以在小鼠中成功表達(dá)膜蛋白，并誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生一系列針對(duì)細(xì)菌和病毒靶標(biāo)的關(guān)鍵抗體。

“我們了解到我們的新抗體生產(chǎn)過程非常有效。如果膜蛋白天然具有免疫原性，我們很容易僅使用基因產(chǎn)生高水平的抗體，”Hansen說。“在免疫接種之前，我們讓免疫接種的宿主為我們工作，而不是費(fèi)力地凈化膜蛋白并試圖在洗滌劑中保持適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)。”

該新研究還描述了一種在試管中表達(dá)和純化膜蛋白并檢測它們與從基因免疫小鼠中提取的血液中的特異性抗體的結(jié)合活性的方法。

通常，產(chǎn)生對(duì)外來蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答需要純化蛋白質(zhì)，然后將其注射到動(dòng)物體內(nèi)。該過程繁瑣，具有挑戰(zhàn)性且耗時(shí)。在目前的研究中，通過直接引入編碼目的蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

通過重組DNA的過程，研究中產(chǎn)生的兩種膜蛋白也被成功地引入細(xì)菌大腸桿菌的膜中。使用來自基因免疫小鼠的血液中存在的特異性抗體首次證明兩種膜蛋白可以在活生物體中重組表達(dá)，正確折疊成適當(dāng)?shù)?-D結(jié)構(gòu)并遷移到大腸桿菌內(nèi)的膜上。這些結(jié)果現(xiàn)在有助于這兩種關(guān)鍵毒力蛋白的結(jié)構(gòu)測定。

這項(xiàng)研究發(fā)表在最新一期的自然出版集團(tuán)期刊“ 科學(xué)報(bào)告”中，有望為對(duì)醫(yī)學(xué)至關(guān)重要的膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供新的見解。

在表面上

膜蛋白涉及生物體中的無數(shù)功能，包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和通信，能量轉(zhuǎn)換和利用，分子運(yùn)輸和催化。由于他們參與了一系列疾病，他們最近成為新一系列治療方法的主要目標(biāo)。實(shí)際上，超過50%的治療靶標(biāo)是膜蛋白。隨著對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能的了解越來越多，預(yù)計(jì)這一數(shù)字將會(huì)上升。

盡管它們?cè)谒拗?病原體相互作用以及藥物/細(xì)胞關(guān)系中作為分子界面具有重要作用，但膜蛋白在目前編目的100,000個(gè)獨(dú)特蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中占不到1%。這主要是由于生產(chǎn)，純化和確定膜蛋白結(jié)構(gòu)所涉及的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。Hansen和她的同事概述了生產(chǎn)抗體特異性蛋白質(zhì)的新策略，這些蛋白質(zhì)由免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生，以應(yīng)對(duì)病原體或其他威脅生物制劑。

在目前的研究中，他們描述了使用基因槍將DNA信息引入小鼠。手持設(shè)備使用一股氣體將含有稱為質(zhì)粒的環(huán)狀DNA浸漬的金顆粒推入小鼠皮膚。金顆粒被稱為微納米復(fù)合物?；驑尲夹g(shù)由生物設(shè)計(jì)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新中心的聯(lián)合主任Stephen A. Johnston開創(chuàng)并開發(fā)。

通過基因槍引入的遺傳物質(zhì)被小鼠樹突細(xì)胞攝取并在真皮組織和淋巴結(jié)中翻譯成膜蛋白。小鼠免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生能夠結(jié)合膜蛋白的特異性抗體來響應(yīng)。雖然遺傳免疫的基本技術(shù)已經(jīng)使用了一段時(shí)間，但該研究首次描述了這種方法對(duì)膜蛋白的廣泛適用性，以及DNA-金微納米復(fù)合物首次應(yīng)用以刺激抗體產(chǎn)生。

檢查了細(xì)菌和病毒威脅

結(jié)果顯示，基因免疫成功地產(chǎn)生了來自兩種生物安全3級(jí)病原體的17種膜蛋白中的12種特異性抗體：土拉弗朗西斯菌和非洲豬瘟病毒(ASFV)。F. tularensis引起疾病tularemia。它是一種廣泛研究的傳染性病原體，因其能夠侵入多種細(xì)胞類型并巧妙地逃避免疫系統(tǒng)而臭名昭著。它是地球上最致病的細(xì)菌之一，只能通過10個(gè)細(xì)胞引起致命的感染。非洲豬瘟病毒由節(jié)肢動(dòng)物攜帶。豬的感染導(dǎo)致致命和無法治愈的出血性疾病，這種疾病已經(jīng)破壞了非洲和東歐地區(qū)的豬群。

對(duì)這些生物體產(chǎn)生的內(nèi)源性疾病蛋白質(zhì)的研究很困難，需要專門的安全設(shè)施和方案，因?yàn)樗鼈兛赡芙o研究人員帶來危險(xiǎn)。所描述的新方法允許通過基于DNA的方法產(chǎn)生這些病原體的膜蛋白和相關(guān)抗體，允許安全處理生物材料而沒有感染風(fēng)險(xiǎn)。

一旦在小鼠中產(chǎn)生了針對(duì)特定膜蛋白的抗體，該組試圖表征所得的小鼠血液或血清。為此，開發(fā)了在疏水性磁珠(IVT-HMB)存在下稱為體外翻譯的新系統(tǒng)。在此，在試管中產(chǎn)生小質(zhì)量的膜蛋白，同時(shí)使用疏水珠提取，然后針對(duì)從基因免疫的小鼠中提取的血清進(jìn)行篩選。在兩種類型的診斷測試或測定(ELISA和蛋白質(zhì)印跡)中檢測所得信號(hào)確定了在小鼠血清中存在對(duì)每種膜蛋白特異的抗體。IVT-HMB方法代表了膜蛋白生產(chǎn)的強(qiáng)大精簡，排除了傳統(tǒng)上需要的艱苦的分離和純化過程。

踏腳石到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

使用X射線成像微小的蛋白質(zhì)晶體是確定詳細(xì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效方法，但該技術(shù)面臨許多挑戰(zhàn)，包括難以生產(chǎn)和純化正確組裝的蛋白質(zhì)。目前的研究標(biāo)志著膜蛋白進(jìn)一步結(jié)構(gòu)表征的起點(diǎn)，使用冷凍EM和X射線晶體學(xué)等技術(shù)。

新研究的共同作者，生物設(shè)計(jì)研究所應(yīng)用結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)中心的主編Petra Fromme強(qiáng)調(diào)了這項(xiàng)新研究的力量：“通過遺傳免疫等技術(shù)產(chǎn)生的抗體范圍打開了高分辨率分子圖像的大門重要的膜蛋白，“她說。“由此產(chǎn)生的抗體有助于以各種重要方式進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，識(shí)別正確組裝的蛋白質(zhì)，幫助誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)組裝成有序的晶體，并穩(wěn)定或捕獲可以使用X射線成像的活躍狀態(tài)的蛋白質(zhì)。”

在下一階段的研究中，該小組計(jì)劃使用相同的免疫程序生產(chǎn)單克隆抗體。這些作為共結(jié)晶結(jié)合因子或配體是必需的，用于通過X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)測定膜蛋白。作者進(jìn)一步指出，通過基因免疫技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體為未來針對(duì)廣泛疾病的治療提供了有吸引力的候選者。

這項(xiàng)研究由生物設(shè)計(jì)研究所的教師共同完成，包括來自醫(yī)學(xué)創(chuàng)新中心(CIM)的Debra Hansen，應(yīng)用結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)中心(CASD)和分子科學(xué)學(xué)院(SMS)，來自CIM的Kathryn Sykes和來自CASD和SMS的Petra Fromme，以及他們的研究人員和學(xué)生團(tuán)隊(duì)，包括：研究科學(xué)家Mark Robida，Andrey Loskutov和Tien Olson，研究員Felicia Craciunescu，John-Charles Rodenberry和Hetal Patel以及來自CIM和博士后Katerina的研究生Xiao Wang來自SMS的Dörner。

用于應(yīng)用該方法的所有必需克隆(質(zhì)粒DNA)可通過DNASU Plasmid Repository獲得，該DNA存儲(chǔ)在Biodesign的個(gè)性化診斷中心。