研究檢測活細(xì)胞中的DNA靶向動力學(xué)

馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家在“ 細(xì)胞生物學(xué)雜志”上進(jìn)行的一項(xiàng)研究揭示了關(guān)于CRISPR-Cas9機(jī)器在活細(xì)胞中的內(nèi)部運(yùn)作的重要新細(xì)節(jié)，這可能對使用強(qiáng)大的基因編輯工具的治療學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生影響。。

“我們對CRISPR-Cas9復(fù)合物如何繞過活細(xì)胞基因組并找到目標(biāo)的細(xì)節(jié)知之甚少，”Vitol Arnett細(xì)胞生物學(xué)教授，生物化學(xué)與分子教授Thoru Pederson博士說。藥理。“我們在這項(xiàng)關(guān)于這種機(jī)器如何工作的研究中學(xué)到的東西對于希望為實(shí)驗(yàn)室和潛在診所開發(fā)工具的基因編輯來說非常重要和有用。”

CRISPR-Cas9復(fù)合物是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的一個組成部分，可以保護(hù)其免受病毒入侵，是一種功能強(qiáng)大的基因編輯系統(tǒng)。CRIPR-Cas9復(fù)合物比以前的技術(shù)更加高效和精確，正在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行調(diào)整，因?yàn)榭茖W(xué)家們正在尋找方法來快速編程和交付它，以選擇性地編輯用于研究的特定基因序列。為了切割一段雙鏈DNA，CRISPR-Cas9利用由大約20個核苷酸制成的指導(dǎo)RNA靶向基因組的特定區(qū)域，然后Cas9復(fù)合物進(jìn)行切割。這使科學(xué)家能夠?qū)⒒蛐蛄幸瞥虿迦牖蚪M中。

由于CRISPR / Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞內(nèi)的工作原理尚不清楚，因此一些傳遞系統(tǒng)和技術(shù)比其他系統(tǒng)和技術(shù)更成功。為了觀察CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞中的作用，Pederson博士及其同事開發(fā)了一種技術(shù)，用不同的熒光分子標(biāo)記指導(dǎo)RNA和Cas9元件，以便同時跟蹤它們。

他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不與Cas9結(jié)合時，指導(dǎo)RNA非常短暫。當(dāng)Cas9和指導(dǎo)RNA組裝時，復(fù)合物更加穩(wěn)定，大約一半在細(xì)胞核中顯示出約15分鐘的壽命，其余的則相當(dāng)穩(wěn)定。

“Cas9穩(wěn)定了指導(dǎo)RNA，”Handerson Ma博士說，他是Pederson實(shí)驗(yàn)室的研究專家，也是細(xì)胞生物學(xué)雜志的共同第一作者。“如果您將指導(dǎo)RNA和Cas9分別送入細(xì)胞中進(jìn)行組裝，那么組裝它將不會那么有效，因?yàn)橐恍┲笇?dǎo)RNA會降解。如果你將它們都輸送到細(xì)胞中，已經(jīng)組裝好了，你可以”我會看到更多的活動。“

該研究小組的其他觀察結(jié)果包括RNA治療研究所助理教授David Grunwald博士和Grunwald實(shí)驗(yàn)室博士后研究員Li-Chun Tu博士提出的Cas9-guide RNA復(fù)合物靶區(qū)的持續(xù)時間確定DNA是否會被切割。當(dāng)引導(dǎo)RNA序列與靶DNA序列完全匹配時，Cas9-引導(dǎo)RNA復(fù)合物在離開前2小時保持結(jié)合，完成切割。對于錯配的指導(dǎo)RNA-靶DNA序列，該復(fù)合物僅在幾分鐘內(nèi)徘徊并且切割受損。

馬云表示，了解這一點(diǎn)后，科學(xué)家們可能會在數(shù)學(xué)上預(yù)測基于CRISPR復(fù)合體在基因組上存在多長時間內(nèi)可能發(fā)生脫靶的情況。

“我們?nèi)匀徊恢繡RISPR的規(guī)則，”馬博士說。“每個人都想知道當(dāng)它被送到活細(xì)胞時會發(fā)生什么。這項(xiàng)研究有助于編寫一份操作手冊。”

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