你知道什么是基因診斷嗎?你知道基因診斷有什么作用嗎?據(jù)最新消息顯示，某些受精卵(種質(zhì))或母體受到環(huán)境或遺傳等的影響，引起的下一代基因組發(fā)生了有害改變，產(chǎn)生了(體質(zhì))疾病，為了有針對(duì)性的解決和預(yù)防，故需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的基因診斷、基因分析才能得到確認(rèn)。

據(jù)了解，單基因遺傳病的診斷主要靠臨床觀察和系列化學(xué)檢查，但生化學(xué)檢查要求有相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物的體液或細(xì)胞，并對(duì)基因產(chǎn)物或代謝異常機(jī)理有所了解，但對(duì)絕大多數(shù)遺傳病而言，還遠(yuǎn)未達(dá)到這種認(rèn)識(shí)。理想的診斷方法是對(duì)患者基因或DNA本身直接進(jìn)行分析，因?yàn)檫@種分析擺脫了上述各種限制。機(jī)體各種組織的核細(xì)胞均有全套基因組DNA，都可以作為分析的材料，而不必考慮表達(dá)問(wèn)題。

基因診斷可分為兩類：

基因直接診斷

直接檢查致病基因本身的異常。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因無(wú)突變、缺失、退化等異常及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病;

基因間接診斷

SSCP、AMP-FLP等技術(shù)均可用于連鎖分析。

基因診斷基本原理

核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一?；蛟\斷技術(shù)它的基本原理是：互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行，也能在DNA和RNA之間進(jìn)行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時(shí)，如果兩者的堿基完全配對(duì)，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。由此可見，進(jìn)行基因檢測(cè)有兩個(gè)必要條件，一是必需的特異的DNA探針;二是必需的基因組DNA。當(dāng)兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時(shí)，就能進(jìn)行分子雜交。

一、基因探針基因探針(probe)就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列，它可以包括整個(gè)基因，也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA。

1.探針的來(lái)源 DNA探針根據(jù)其來(lái)源有3種：一種來(lái)自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針(genomic probe);另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNa 探針(cDNa probe)。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。

基因診斷

2.探針的制備 進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過(guò)分子克隆(molecular cloning)獲得的?？寺∈侵赣脽o(wú)性繁殖方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn)，應(yīng)先制備基因組文庫(kù)，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機(jī)片段，將這些片段體外重組到運(yùn)載體(噬菌體、質(zhì)粒等)中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸肝菌，這時(shí)在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過(guò)原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增，制備出大量的探針。

為了制備cDNA 探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA)，cDNA與待測(cè)基因的編碼區(qū)有完全相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過(guò)程中切除。

寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長(zhǎng)度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。

3.探針的標(biāo)記 為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào),通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來(lái)已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時(shí)間較長(zhǎng),而且避免了同位素的污染。最常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nicktranslation)。

探針的標(biāo)記也可以采用隨機(jī)引物法，即向變性的探針溶液加入6個(gè)核苷酸的隨機(jī)DNA小片段，作為引物，當(dāng)后者與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合后，按堿基互補(bǔ)原則不斷在其3’OH端添加同位素標(biāo)記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。

二、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)，又簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。它們的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為從基因組中分離目的基因提供了必要的手段.限制酶能特異地識(shí)別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來(lái)。

限制酶主要來(lái)源于原核生物，是一組能水解DNA磷酸二酯鍵的酶。迄今已發(fā)現(xiàn)的限制酶多達(dá)數(shù)百種，分為三類。在基因工程中使用的主要是第二類。限制酶根據(jù)其來(lái)源命名。

每種限制酶識(shí)別和切割的通常為4-6個(gè)核苷酸序列，稱為限制性位點(diǎn)(restriction sites)或切點(diǎn)。限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種：第一種是交錯(cuò)切割，即兩條鏈的切點(diǎn)不在同一水平而是相隔數(shù)個(gè)堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補(bǔ)的單鏈，這種末端容易互補(bǔ)連接，稱為粘性末端(cohesive terminus);第二種為平整切割。

限制酶的上述特性在基因工程和基因診斷中具有重要用途：①首先不論DNA的來(lái)源如何，用同一種內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的粘性末端很容易重新連接，因此很容易將人和細(xì)菌或人和質(zhì)粒任何兩個(gè)DNA片段連接在一起，即重新組合，這是重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)。②人類的基因組很大，不切割無(wú)法分析其中的基因。限制酶能把基因組在特異的部位切開，即切割不是隨機(jī)的，因而從每個(gè)細(xì)胞的基因組得到的是相同的一組長(zhǎng)度各異的片段。這些可能含有某一基因的片段可用電泳分離，并加以研究。③由于限制酶的特異性，如果識(shí)別位點(diǎn)的堿基發(fā)生了改變，限制酶將不再能切割;同樣，堿基的改變也可能導(dǎo)致出現(xiàn)新的酸切位點(diǎn)。在人類基因組中，這兩種情況是十分常見的，而切點(diǎn)的消失或出現(xiàn)將影響獲得的DNA片段的長(zhǎng)度，表現(xiàn)為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，這在基因的連鎖診斷中具有極重要的意義。

三、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性一個(gè)人的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100-500個(gè)堿基對(duì)就有一個(gè)是不相同的。換言之，如果把兩套基因組DNA(各3.2×109bp)排列起來(lái)，那么平均有1000萬(wàn)處不同，它們多位于內(nèi)含子序列中。實(shí)際上，除單卵雙生子外，人群中沒有兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA是完全相同的。

DNA的多態(tài)性雖可通過(guò)DNA測(cè)序檢出，但用限制酶消化卻是最常用的檢測(cè)方法。

1.RFLP由于堿基的變異可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)出現(xiàn)，從而引起不同個(gè)體在用同一限制酶切時(shí)，DNA片段長(zhǎng)度出現(xiàn)差異，這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長(zhǎng)度的差異，稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragmentlength polymporphism, RFLP)。RFLP反映了常見的個(gè)體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Southern印跡雜交法檢出。用Southern雜交檢出RFLP時(shí)，如探針跨越切點(diǎn)，則被切開的兩個(gè)片段均可與探針雜交，從而顯示兩條雜交帶。

2.兩點(diǎn)RFLP

(1)點(diǎn)多態(tài)(point polymorphism)：是由于單個(gè)或少數(shù)堿基的改變引起酶切點(diǎn)的出現(xiàn)或消失所致的RFLP。上述的RFLP即屬于這一類。它們屬經(jīng)典的RFLP。在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)數(shù)以百計(jì)的此類多態(tài)位點(diǎn)。

(2)數(shù)目變異的串連重復(fù)(variable number tandem repeats,VNTR)：上述經(jīng)典的單個(gè)堿基取代所致的RFLP一般只能檢測(cè)到一種雜合性的兩種形式，即“有”或“無(wú)”某個(gè)限制酶切位點(diǎn)，而且每個(gè)位點(diǎn)在人群中的雜合子頻率通常不會(huì)超過(guò)50%，當(dāng)被測(cè)個(gè)體為純合狀態(tài)時(shí)，利用RFLP就無(wú)法得到所需要的多態(tài)信息。此外，在整個(gè)基因組中，這類RFLP目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)量還有限，并分布不勻。

但是，在人類基因組中還存在一類DNA重復(fù)序列，稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛，每一個(gè)單位通常只有16-28bp長(zhǎng)，但其重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時(shí)，只要酶切點(diǎn)不在重復(fù)區(qū)內(nèi)，就可能得到各種長(zhǎng)度不同的片段與小衛(wèi)星DNA不同，另一類重復(fù)序列是衛(wèi)星DNA。它們的基本序列有1-6bp，如(TA)n、(CGG)n等，通常重復(fù)10-60次并呈高度的多態(tài)性。

VNTR具有高度的變異性，同時(shí)也是按照孟德爾方式遺傳的，因此是很好的遺傳標(biāo)記，由于它們類型眾多和在基因組中分布廣泛，因而在基因連鎖診斷中應(yīng)用日益廣泛。

據(jù)悉，基因診斷又稱DNA診斷或分子診斷。用目前人類對(duì)基因組的認(rèn)識(shí)和分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，檢查分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平，對(duì)普通遺傳病或家族遺傳病做出的診斷。