YCJ制

XXXXXXXX

項目名稱EZ-PCR檢測支原體驗證方案

項目編號

起草人

審核人

批準人

日期

日期

日期

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YCJ制

目錄

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

概述....................................................................................................................................3

適用范圍............................................................................................................................3

驗證目的............................................................................................................................3

驗證項目............................................................................................................................3

參考文件............................................................................................................................3

驗證小組成員及職責(zé)........................................................................................................4

驗證過程............................................................................................................................4

實驗材料....................................................................................................................4

實驗儀器及設(shè)備........................................................................................................4

專屬性驗證................................................................................................................4

檢測限驗證................................................................................................................6

重現(xiàn)性驗證................................................................................................................8

耐用性驗證................................................................................................................9

7.1.

7.2.

7.3.

7.4.

7.5.

7.6.

8.

9.

驗證結(jié)果分析..................................................................................................................11

驗證評價..........................................................................................................................11

10.驗證結(jié)論..........................................................................................................................11

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1.概述

支原體(Mycoplasma)屬于柔膜體綱，是介于細菌和病毒之間的一類無細胞壁的

原核細胞微生物，是目前所知能在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小的微生物。與梭菌

屬、酸桿菌屬及鏈球菌屬在進化上相近。支原體是細胞污染物中比較常見的一種，

細胞受支原體污染程度較輕時，不會表現(xiàn)出明顯的癥狀，但一旦這種潛伏的污染爆發(fā)

時，細胞會大量脫落，細胞培養(yǎng)液會變渾濁。原代細胞和傳代細胞都可能遭受支原體

污染，根據(jù)國外不同實驗室的調(diào)查結(jié)果顯示，有15%-80%的細胞被支原體污染，傳

代細胞的污染率高于原代細胞。盡管自然界中存在的支原體有120多種，但污染細

胞的支原體主要有5種，分別為牛源的萊氏無膽甾原體和精氨酸支原體，人源的口

腔支原體和發(fā)酵支原體，豬源的豬鼻支原體，這5種支原體占所有支原體污染的95%

以上。支原體污染可能來自操作人員和細胞培養(yǎng)用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能

來自于本身已被污染的細胞系和毒種。細胞受支原體污染后，功能和活性都會受到影

響，會帶來不可靠的實驗結(jié)果和不安全的細胞制品，因此對細胞進行支原體檢測實屬

必要。

我國藥典第三部明確規(guī)定主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨

床治療用細胞進行支原體檢查時，應(yīng)同時進行培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法（DNA染

法）。直接培養(yǎng)法具有較高的靈敏度，但整個實驗所需周期長，指示細胞法相對實驗

周期短。生物化學(xué)法干擾因素較多，ELISA法檢測范圍有限，因此這兩個方法都不

能得到普及。在這些方法出現(xiàn)的同時，PCR法得到了發(fā)展，PCR因其高敏感性、明

確及快捷的特點簡化了細胞培養(yǎng)中支原體污染檢測過程。BI的EZ-PCR方法檢測支

原體，檢測用的樣品僅經(jīng)過離心分離及懸浮在緩沖液中即可開始PCR反應(yīng)。瓊脂糖

凝膠電泳后，陽性模板得到一個270bp的片段，整個過程只需3-4小時。

2.適用范圍

本驗證方法適用于BI公司的EZ-PCR支原體污染檢測試劑盒檢測細胞終制品中支

原體污染方法的驗證

3.驗證目的

建立細胞終制品的EZ-PCR支原體檢測，并對其有效性進行評價，確保試驗方法

的穩(wěn)定性，保證試測結(jié)果真實可靠。

4.驗證項目

對該方法的專屬性、檢測限、重現(xiàn)性及耐用性逐一進行驗證。

5.參考文件

《中國藥典》2015版3301支原體檢查法

《中國藥典》2015版9201藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則

《終制品支原體檢測標準操作規(guī)程》

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6.驗證小組成員及職責(zé)

姓名職責(zé)

7.驗證過程

7.1.實驗材料

7.1.1.菌種：肺炎支原體（ATCC15531株）、口腔支原體（ATCC23714株）、丁酸梭菌、

酸桿菌、肺炎鏈球菌。

7.1.2.細胞：無支原體污染的Vero細胞。

7.1.3.培養(yǎng)基：支原體液體培養(yǎng)基、精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基、支原體半流體培養(yǎng)基、DMEM

完全培養(yǎng)基、DMEM無抗生素培養(yǎng)基。

7.1.4.試劑：二苯甲酰胺熒光染料工作液、固定液、封片液、SYBR熒光染料等。

7.1.5.試劑盒：EZ-PCR支原體污染檢測試劑盒、DNA提取試劑盒等。

7.1.6.其他：無菌水、Marker、瓊脂糖等。

7.2.實驗儀器及設(shè)備

PCR儀、電泳儀、離心機、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、熒光顯微鏡等。

7.3.專屬性驗證

7.3.1.定義：專屬性是指檢測樣品中可能存在的特定微生物種類的能力，其專屬性驗證應(yīng)

確認檢測系統(tǒng)中的外來成分不得干擾試驗而影響結(jié)果。

7.3.2.說明：本實驗專屬性驗證采用無支原體污染的Vero細胞代替樣品細胞來確認樣品細

胞DNA的存在是否對檢驗結(jié)果造成影響；用與支原體進化相似的丁酸梭菌、酸桿

菌、肺炎鏈球菌代替支原體進行檢驗，來驗證相似微生物的DNA是否對檢驗結(jié)果造

成影響。

細胞驗證：用DNA提取試劑盒提取Vero細胞DNA，過程中注意防止支原體污

染，依據(jù)EZ-PCR支原體污染檢測試劑盒使用說明對提取的DNA進行EZ-PCR擴增，

電泳，最后進行凝膠成像，觀察結(jié)果，在270bp左右是否出現(xiàn)特異性條帶。以加入

支原體菌株的Vero細胞樣品作為樣品陽性對照；以上實驗做5組平行。結(jié)果記錄如

下表：（原始電泳圖見附件一）

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項目

陰性對照

編號

1

1

無支原體

Vero細胞

2

3

4

5

實驗人/日期

結(jié)果

支原體陽性

Vero細胞

項目

陽性對照

編號

1

1

2

3

4

5

審核人/日期

結(jié)果

注：在“結(jié)果”中，270bp左右無條帶記錄為“—”，有條帶記錄為“+”。

結(jié)果說明：當(dāng)陰性對照為“—”，陽性對照為“+”，實驗結(jié)果方有效。若“無支原體

Vero細胞”結(jié)果均為“—”，“支原體陽性Vero細胞”結(jié)果均為“+”，則說明樣品細

胞DNA的存在不會對檢驗結(jié)果造成影響，若結(jié)果有異，則需重新驗證。

7.3.4.相似菌株驗證：用試劑盒分別提取丁酸梭菌、酸桿菌、肺炎鏈球菌DNA，方法同

Vero細胞驗證，每個樣品做5組平行，結(jié)果記錄如下：（原始電泳圖見附件二）

項目

陰性對照

編號

1

1

2

丁酸梭菌3

4

5

1

2

肺炎鏈球菌3

4

5

實驗人/日期

結(jié)果

口腔支原體

酸桿菌

項目

陽性對照

編號

1

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

審核人/日期

結(jié)果

注：在“結(jié)果”中，270bp左右無條帶記錄為“—”，有條帶記錄為“+”。

結(jié)果說明：當(dāng)陰性對照為“—”，陽性對照為“+”，實驗結(jié)果方有效。若“丁酸梭菌”

“酸桿菌”“肺炎鏈球菌”結(jié)果均為“—”，“口腔支原體”結(jié)果均為“+”，則說明

與支原體類似菌株不會對檢驗結(jié)果造成影響，若結(jié)果有異，則需重新驗證。

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7.4.檢測限驗證

7.4.1.定義：檢測限是指在替代方法設(shè)定的檢驗條件下，樣品中能被檢出的微生物的最低

數(shù)量。

7.4.2.說明：檢測限確定的方法是在有樣品中接種較低濃度的支原體（每單位不超過5CFU），

然后分別采用藥典直接培養(yǎng)法、指示細胞培養(yǎng)法和EZ-PCR法對支原體進行檢驗，以

檢出與否來比較藥典種方法與EZ-PCR方法的差異，最后采用卡方檢驗（χ2）來評價

這些方法的檢測限是否存在差異。

7.4.3.方法：將肺炎支原體和口腔支原體分別接種于適宜的培養(yǎng)基中，經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng)至

培養(yǎng)基變，盲傳兩代后，將培養(yǎng)物進行10倍稀釋，肺炎支原體取10-7、10-8、10-9、

10-10梯度菌液，口腔支原體取10-3、10-4、10-5、10-6梯度菌液。制成待測供試品。兩

種菌株每個梯度各取1ml菌液分別進行直接培養(yǎng)、指示細胞培養(yǎng)和EZ-PCR,每個培

養(yǎng)做三組平行，結(jié)果記錄如下：（原始記錄見附件三）

菌株

肺炎

支原

體

梯度

10-7

10-8

10-9

10-10

10-3

10-4

10-5

10-6

直接培養(yǎng)法指示細胞法

審核人/日期

EZ-PCR

口腔

支原

體

實驗人/日期

注：對于直接培養(yǎng)法和指示細胞法，“+”表示檢查結(jié)果為陽性，“—”表示檢查結(jié)果

為陰性；對于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特異性條帶，“—”表示在270bp

左右無特異性條帶。

對結(jié)果進行卡方檢驗分析。

7.4.4.直接培養(yǎng)法操作步驟

7.4.4.1.支原體培養(yǎng)基靈敏度檢查

7.4.4.1.1.操作：將肺炎支原體、口腔支原體接種于適宜的支原體培養(yǎng)基中，經(jīng)36℃±1℃

培養(yǎng)至培養(yǎng)基變，盲傳兩代后，將培養(yǎng)物接種至待檢培養(yǎng)基中，做10倍系列

稀釋，肺炎支原體稀釋至10-7~10-9，接種在支原體肉湯培養(yǎng)基中；口腔支原體稀

釋至10-3~10-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基內(nèi)。每個稀釋度接種3支試管，

置于36℃±1℃培養(yǎng)7~14天，觀察培養(yǎng)基變結(jié)果。（記錄見附件三）

7.4.4.1.2.結(jié)果判定：以接種后培養(yǎng)基管數(shù)的2/3以上呈現(xiàn)變的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的

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靈敏度（肺炎支原體應(yīng)達到10-8），口腔支原體應(yīng)達到10-4。

7.4.4.2.檢查法

7.4.4.2.1.操作：供試品如在分裝后24小時以內(nèi)進行支原體檢查者可貯存于2~8℃；超過

24小時應(yīng)置于-20℃貯存。

半流體培養(yǎng)基在使用前應(yīng)煮沸10~15分鐘，冷卻至56℃左右，然后加入滅能小牛

血清（培養(yǎng)基：血清為8:2），并可酌情加入適量青霉素，充分搖勻。液體培養(yǎng)基

除無需煮沸外，使用前亦應(yīng)同樣補加上述成分。

取每只裝量為10ml的支原體液體培養(yǎng)基各4支、相應(yīng)的支原體半流體培養(yǎng)基各2

支，每只培養(yǎng)基接種供試品1，置36℃±1℃培養(yǎng)21天。于接種后的第7天從4

支支原體液體培養(yǎng)基中各取2支進行次代培養(yǎng)，每支培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)種至相應(yīng)的支

原體半流體培養(yǎng)基及支原體液體培養(yǎng)基各2支，置36℃±1℃培養(yǎng)21天，每隔3

天觀察1次。（記錄見附件三）

7.4.4.2.2.結(jié)果判定：培養(yǎng)結(jié)束時，如接種供試品的培養(yǎng)基均無支原體生長，則供試品判為

合格；如疑有支原體生長，可取加倍量供試品復(fù)試，如無支原體生長，供試品判

斷為合格，如仍有支原體生長，則供試品判為不合格。

7.4.5.指示細胞培養(yǎng)法步驟

7.4.5.1.預(yù)處理

7.4.5.1.1.指示細胞：取培養(yǎng)的Vero細胞經(jīng)消化后，制成每1ml含105的細胞懸液，以每孔

0.5ml接種6孔細胞培養(yǎng)板，每孔再加無抗生素培養(yǎng)基3ml，于5%二氧化碳孵箱

中36℃±1℃培養(yǎng)過夜，備用。

7.4.5.1.2.測定法：于制備好的指示細胞培養(yǎng)板中加入支原體菌懸液1ml，置5%二氧化碳

孵箱36℃±1℃培養(yǎng)3~5天。指示細胞培養(yǎng)物至少傳代一次，末次傳代培養(yǎng)用含

蓋玻片的6孔培養(yǎng)3~5天后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入固定液5ml，放置5

分鐘，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分鐘，吸出固定液，使蓋玻片在空

氣中干燥，加二苯甲酰胺熒光染料工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，吸出染

液，每孔用水5ml洗3次，吸出水，蓋玻片于空氣中干燥，取潔凈載玻片加封片

液1滴，分別將蓋玻片面向下蓋在封片液上制成封片。用熒光顯微鏡觀察。用無

抗生素培養(yǎng)基1ml代替支原體菌懸液，同法操作，作為陰性對照。

取稀釋梯度為10-2的肺炎支原體和口腔支原體混合液1ml代替支原體菌懸液作為

陽性對照。（結(jié)果記錄于附件三）。

7.4.5.2.結(jié)果判定

7.4.5.2.1.陰性對照：僅見指示細胞的細胞核呈現(xiàn)黃綠熒光。

7.4.5.2.2.陽性對照：熒光顯微鏡下除細胞外，可見大小不等、不規(guī)則的熒光著顆粒。

當(dāng)陰性及陽性對照結(jié)果均成立時，試驗有效。

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如果供試品為陰性，則供試品判為合格；如供試品結(jié)果為陽性或可疑時，應(yīng)進行

重試；如仍為陽性時，供試品判為不合格。

7.5.重現(xiàn)性驗證

7.5.1.定義：重現(xiàn)性是指相同的樣品在正常的實驗條件（如實驗地點、實驗人員、儀器、

試劑的批次等）發(fā)生變化時，所得檢驗結(jié)果的精密度。

7.5.2.說明：在待測樣品中接種稀釋梯度為10-2的口腔支原體和肺炎支原體混合菌懸液1ml，

采用直接培養(yǎng)法、指示細胞法和EZ-PCR，分別由三個同事在不同的時間使用不同的

PCR儀進行檢驗，最后采用卡方檢驗（χ2）來評價這些種方法的檢測限是否存在差

異。

7.5.3.方法：

7.5.3.1.供試液制備：取細胞制備過程中細胞上清液作為檢測樣品，每次檢驗量為1ml，另

加入稀釋梯度為10-2的口腔支原體和肺炎支原體混合菌懸液1ml，因此總體積為

2ml，細胞上清取樣后置于-20℃保存。

7.5.3.2.直接培養(yǎng)法、指示細胞法和EZ-PCR方法如前所述。

7.5.3.3.第一次試驗：分別由同事A、同事B、同事C在相同實驗條件下使用PCR儀○1進

行實驗，每次做10個平行，結(jié)果記錄如下表：（原始記錄見附件四）

第一次試驗(PCR儀○1)

名稱

同事A

直接培養(yǎng)法指示細胞法EZ-PCR

同事B

同事C

實驗人/日期審核人/日期

注：對于直接培養(yǎng)法和指示細胞法，“+”表示檢查結(jié)果為陽性，“—”表示檢查結(jié)果

為陰性；對于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特異性條帶，“—”表示在270bp

左右無特異性條帶。

7.5.3.4.第二次試驗：一周后，分別由同事A、同事B、同事C在相同實驗條件下使用PCR

儀○2進行實驗，每次做10個平行，結(jié)果記錄如下表：（原始記錄見附件五）

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第二次試驗（PCR儀○2）

名稱

同事A

直接培養(yǎng)法指示細胞法EZ-PCR

同事B

同事C

實驗人/日期審核人/日期

注：對于直接培養(yǎng)法和指示細胞法，“+”表示檢查結(jié)果為陽性，“—”表示檢查結(jié)果

為陰性；對于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特異性條帶，“—”表示在270bp

左右無特異性條帶。

7.5.3.5.第三次試驗：兩周后，分別由同事A、同事B、同事C在相同實驗條件下使用PCR

儀○3進行實驗，每次做10個平行，結(jié)果記錄如下表：（原始記錄見附件六）

第三次試驗（PCR儀○3）

名稱

同事A

直接培養(yǎng)法指示細胞法EZ-PCR

同事B

同事C

實驗人/日期審核人/日期

注：對于直接培養(yǎng)法和指示細胞法，“+”表示檢查結(jié)果為陽性，“—”表示檢查結(jié)果

為陰性；對于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特異性條帶，“—”表示在270bp

左右無特異性條帶。

7.5.4.結(jié)果分析：對上述結(jié)果進行卡方檢驗，評價方法間的差異。

對每次PCR的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，對重現(xiàn)性進行評價。

7.6.耐用性驗證

7.6.1.定義：耐用性是指當(dāng)方法參數(shù)有小的刻意變化時，檢驗結(jié)果不受影響的能力，為方

法正常使用時的可靠性提供依據(jù)。

7.6.2.說明：本次耐用性對樣品存儲溫度、存儲時間、樣品加樣量進行驗證。

7.6.3.方法：

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7.6.3.1.存儲溫度耐用性驗證：取細胞培養(yǎng)上清液，加入適量支原體菌懸液，配制成已知支

原體陽性細胞培養(yǎng)上清液。第一組于4℃保存0天（即取即檢）、2天、7天、15

天后分別取樣進行EZ-PCR檢驗；第二組于-20℃保存0天（即取即檢）、2天、7

天、15天后分別取樣進行EZ-PCR檢驗；每次檢驗做5組平行，結(jié)果記錄如下表：

（原始電泳圖見附件七）

組號平行

陰性對照

陽性對照

1

第一組2

3

4

5

陰性對照

陽性對照

1

第二組2

3

4

5

實驗人/日期

0天2天后

審核人/日期

7天后15天后

注：陰性對照結(jié)果為“—”（即不特異性條帶），陽性對照結(jié)果為“+”（即有特異

性條帶）時，試驗結(jié)果方有效。

7.6.3.2.加樣量耐用性驗證：取已知支原體陽性細胞培養(yǎng)上清液進行EZ-PCR，其中樣品量

分別加1ul、3ul、5ul、6ul，其余用無菌水補齊，每組做5個平行，結(jié)果記錄如下

表：（原始電泳圖見附件八）

平行

陰性對照

陽性對照

1

2

3

4

5

1ul3ul5ul6ul

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試驗人/日期審核人/日期

注：陰性對照結(jié)果為“—”（即不特異性條帶），陽性對照結(jié)果為“+”（即有特異

性條帶）時，試驗結(jié)果方有效。

7.6.4.耐用性驗證結(jié)果分析：經(jīng)過對存儲溫度，存儲時間及加樣量的耐用性驗證，可初步

判斷EZ-PCR檢測支原體污染的耐用性程度，同時也可初步確定樣品存儲溫度、存

儲時間及加樣量的誤差允許范圍，為后續(xù)實驗提供參考。

8.驗證結(jié)果分析

9.驗證評價

10.驗證結(jié)論

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