DBXX/XXXXX—XXXX

10報告

根據(jù)檢測結(jié)果，出具報告。

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DBXX/XXXXX—XXXX

附錄A

（規(guī)范性附錄）

貓泛白細胞減少癥病毒、杯狀病毒、皰疹1型病毒的多重PCR檢測

采用PCR方法，特異性擴增貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)的NS基因序列、貓杯狀病毒(FCV)的ORF2

基因序列以及貓1型皰疹病毒(FHV-I)的TK基因序列，用于貓泛白細胞減少癥病毒、杯狀病毒、皰疹1

型病毒的多重檢測。

A.1RNA和DNA的提取

按照試劑盒說明書分別提取病毒RNA和DNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將提取的DNA和反轉(zhuǎn)

得到的cDNA于-20℃保存、備用。

A.2PCR反應(yīng)

以FCV的cDNA和FPV、FHV-I的DNA混合物作為多重PCR的模板進行PCR擴增，擴增

引物見表1，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，

30個循環(huán)；72℃10min。

表A.1

Primers

FPV

多重PCR引物序列

Length

392bp

Sequences(5'-3')

ATGGTTGGTGACTCTTTGTTT

TACATTTGATTGACACTTCCC

FCVAACCTGCGCTAACGTGCTT

CAGTGACAATACACCCAGAA

922bp

FHV-IGACGTGGTGAATTATCAG

CAACTAGATTTCCACCAGG

290bp

A.3PCR產(chǎn)物

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

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附錄B

（規(guī)范性附錄）

貓冠狀病毒RT-PCR檢測方法

采用RT-PCR方法，特異性擴增貓冠狀病毒ORF1b基因片段，用于貓冠狀病毒的檢測。

B.1病毒RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

按照病毒RNA提取試劑盒操作方法進行RNA的提取，按照cDNA第一鏈合成試劑盒操作方法將

RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA于-20℃保存、備用。

B.2PCR反應(yīng)引物

上游引物序列（5’-3’）：GTGATGCTATCATGACTAG

下游引物序列（5’-3’）：CACCATTACAACCTTCTAA

B.3PCR反應(yīng)條件

95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s，48℃退火35s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。

B.4PCR產(chǎn)物

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的片段大小為417bp。

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附錄C

（規(guī)范性附錄）

貓白血病病毒巢式RT-PCR檢測方法

采用巢式RT-PCR方法，特異性擴增貓白血病病毒基因片段，用于貓白血病病毒的檢測。

C.1病毒RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

按照病毒RNA提取試劑盒操作方法進行RNA的提取，按照cDNA第一鏈合成試劑盒操作方法將

RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA于-20℃保存、備用。

C.2

C.2.1

PCR反應(yīng)引物

第一次反應(yīng)引物

上游引物序列（5’-3’）：ACAGCAGAAGTTTCAAGGCC

下游引物序列（5’-3’）：GACCAGTGATCAAGGGTGAG

C.2.2第二次反應(yīng)引物

上游引物序列（5’-3’）：GCTCCCCAGTTGACCAGAGT

下游引物序列（5’-3’）：GCTTCGGTACCAAACCGAAA

C.3

C.3.1

PCR反應(yīng)

第一次PCR反應(yīng)

以制備的cDNA為模板，進行第一次PCR反應(yīng)，條件如下：95℃預(yù)變性2min；95℃變性45s，58℃

退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。

C.3.2第二次PCR反應(yīng)

以第一次PCR產(chǎn)物為模板，進行第二次PCR反應(yīng)，條件如下：95℃預(yù)變性2min；95℃變性45s，

58℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。

C.4PCR產(chǎn)物

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的片段大小為601bp。

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附錄D

（規(guī)范性附錄）

貓免疫缺陷病毒巢式RT-PCR檢測方法

采用巢式RT-PCR方法，特異性擴增貓免疫缺陷病毒pol基因片段，用于貓免疫缺陷病毒的檢測。

D.1病毒RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

按照病毒RNA提取試劑盒操作方法進行RNA的提取，按照cDNA第一鏈合成試劑盒操作方法將

RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA于-20℃保存、備用。

D.2

D.2.1

PCR反應(yīng)引物

第一次反應(yīng)引物

上游引物序列（5’-3’）：TGGCCWYTAWCWAATGAAAARATWGAAGC

下游引物序列（5’-3’）：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC

D.2.2第二次反應(yīng)引物

上游引物序列（5’-3’）：TGAAAARATWGAAGCHTTAACAGAMATAG

下游引物序列（5’-3’）：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC

D.3

D.3.1

PCR反應(yīng)

第一次PCR反應(yīng)

以制備的cDNA為模板，進行第一次PCR反應(yīng)，條件如下：95℃預(yù)變性2min；95℃變性45s，58℃

退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。

D.3.2第二次PCR反應(yīng)

以第一次PCR產(chǎn)物為模板，進行第二次PCR反應(yīng)，條件如下：95℃預(yù)變性2min；95℃變性45s，

58℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。

D.4PCR產(chǎn)物

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的片段大小為578bp。

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附錄E

（規(guī)范性附錄）

貓血巴爾通體PCR檢測方法

采用PCR方法，特異性擴增貓血巴爾通體16SrDNA基因片段，用于貓血巴爾通體的檢測。

E.1DNA的提取

按照DNA提取試劑盒操作方法進行，提取的DNA于-20℃保存、備用。

E.2PCR反應(yīng)引物

上游引物序列（5’-3’）：TCACAATGGACGAAAGTCTG

下游引物序列（5’-3’）：CCAAACATCTCAAGACACGAG

E.3PCR反應(yīng)

以提取的DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，條件如下：

95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

E.4PCR產(chǎn)物

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的片段大小為711bp。

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