由于基因測(cè)序的不斷進(jìn)步，科學(xué)家們已經(jīng)在我們的遺傳密碼中發(fā)現(xiàn)了幾乎所有的A，T，C和G核苷酸。但是要完全理解人類基因組是如何編碼我們的，我們需要更進(jìn)一步，繪制每個(gè)基因的功能。這是DNA元素百科全書(ENCODE)項(xiàng)目的目標(biāo)，該項(xiàng)目由國(guó)家人類基因組研究所資助，并在2003年人類基因組計(jì)劃之后推出。雖然已經(jīng)完成了許多工作 - 映射蛋白質(zhì)-DNA相互作用和不同表觀遺傳狀態(tài)的遺傳 - 理解DNA序列的功能還需要破譯由其編碼的RNA的目的，以及哪些蛋白質(zhì)與這些RNA結(jié)合。

這種RNA結(jié)合蛋白(RBPs)通過控制各種轉(zhuǎn)錄后過程來調(diào)節(jié)基因表達(dá) - 指導(dǎo)RNA進(jìn)入細(xì)胞的位置，它們的穩(wěn)定性以及合成的蛋白質(zhì)。然而，這些重要的RNA-蛋白質(zhì)關(guān)系仍難以編目，因?yàn)榇蠖鄶?shù)必要的實(shí)驗(yàn)難以完成且難以準(zhǔn)確解釋。

在一項(xiàng)新的研究中，麻省理工學(xué)院的生物學(xué)家團(tuán)隊(duì)及其合作者使用一步，無偏倚的方法描述了78種人類RBP的結(jié)合特異性，該方法可以有效而精確地確定這些蛋白質(zhì)所需的RNA序列和結(jié)構(gòu)的光譜。他們的研究結(jié)果表明，RBP不僅識(shí)別特定的RNA片段，而且通常受到上下文特征的影響，如同所討論的RNA的折疊結(jié)構(gòu)，或RNA結(jié)合序列側(cè)翼的核苷酸。

“RNA從未在細(xì)胞中裸露，因?yàn)榭傆械鞍踪|(zhì)結(jié)合，引導(dǎo)和修飾它，”計(jì)算和系統(tǒng)生物學(xué)博士生導(dǎo)師Christopher Burge說。該項(xiàng)目，生物學(xué)和生物工程教授，科赫綜合癌癥研究所的校外成員，麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)廣泛研究所的準(zhǔn)成員，以及該研究的高級(jí)作者。“如果你真的想要了解轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，那么你需要對(duì)這些相互作用進(jìn)行表征。在這里，我們利用深度測(cè)序來更準(zhǔn)確地描述蛋白質(zhì)與RNA結(jié)合的位置和位置。”

麻省理工學(xué)院博士后Daniel Dominguez，前研究生Peter Freese和現(xiàn)任研究生Maria Alexis是該研究的主要作者，該研究是ENCODE項(xiàng)目的一部分，于6月7日出現(xiàn)在Molecular Cell上。

一種瘋狂的方法

從RNA誕生的那一刻起，它就被RBP所覆蓋，幾乎控制著生命周期的每個(gè)方面。RBP通常含有結(jié)合結(jié)構(gòu)域，三維折疊結(jié)構(gòu)，其可附著于稱為基序的RNA上的特定核苷酸序列。因?yàn)樵谌祟惢蚪M中發(fā)現(xiàn)了超過1,500種不同的RBP，生物學(xué)家需要一種方法來系統(tǒng)地確定哪些蛋白質(zhì)與哪些RNA基序結(jié)合。

在考慮了許多不同的方法來分析RNA-蛋白質(zhì)相互作用，無論是直接在細(xì)胞內(nèi)(體內(nèi))還是在試管中分離(體外)，生物學(xué)家都采用了一種名為RNA Bind-n-Seq的體外方法( RBNS)，由前Burge實(shí)驗(yàn)室博士后和共同作者Nicole Lambert在四年前開發(fā)的。

盡管蘭伯特之前只測(cè)試了一小部分蛋白質(zhì)，但RBNS超越了其他方法，因?yàn)樗且环N定量方法，揭示了低親和力和高親和力的RNA-蛋白質(zhì)相互作用，只需要一個(gè)程序步驟，并篩選幾乎所有可能的RNA基序。這項(xiàng)新研究提高了檢測(cè)的通量，系統(tǒng)地以高分辨率探索超過70種人類RBP的結(jié)合特異性。

Dominguez說：“即使是最初的小樣本，也很清楚RBNS是要走的路，在過去三年半的時(shí)間里，我們逐漸采用這種方法。”“由于單個(gè)RBP可以從數(shù)十億個(gè)獨(dú)特的RNA分子中進(jìn)行選擇，我們的方法可以為您提供更多的能力來檢測(cè)所有可能的目標(biāo)，同時(shí)考慮到RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和背景特征。這是一個(gè)非常深入和詳細(xì)的分析。”

首先，研究人員對(duì)人類RBPs進(jìn)行了純化，將它們與大約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的隨機(jī)生成的合成RNA混合，這幾乎代表了RBP可以結(jié)合的所有RNA。接下來，他們提取了RBP及其結(jié)合的RNA并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。在加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校和康涅狄格大學(xué)健康研究所的合作者的幫助下，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了額外的分析，以收集這些RNA-蛋白質(zhì)相互作用在實(shí)際細(xì)胞中的樣子，并推斷出RBP的細(xì)胞功能。

研究人員預(yù)計(jì)大多數(shù)RBP與獨(dú)特的RNA基序結(jié)合，但令他們驚訝的是，他們發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果：許多蛋白質(zhì)，無論結(jié)構(gòu)類別如何，似乎都喜歡類似的短的，未展開的核苷酸序列基序。

“人類細(xì)胞表達(dá)了數(shù)十萬種不同的轉(zhuǎn)錄本，因此您可能會(huì)認(rèn)為每個(gè)RBP都會(huì)結(jié)合略微不同的RNA序列以區(qū)分目標(biāo)，”Alexis說。“事實(shí)上，人們可能會(huì)認(rèn)為具有不同的RBP基序?qū)⒋_保最大的靈活性。但事實(shí)證明，自然界已經(jīng)建立了大量的冗余;多種蛋白質(zhì)似乎結(jié)合了相同的短線性序列。”

具有不同目標(biāo)和功能的冗余圖案

RBP結(jié)合偏好的這種重疊向科學(xué)家們表明，除了基序序列之外，還必須有一些其他指示物，這些指示物表示RNA靶向的RBP。事實(shí)證明，這些信號(hào)源于圖案的間距以及其結(jié)合位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸堿基。對(duì)于靶向非線性RNA序列的較不常見的RBP，RNA折疊的精確方式似乎也影響結(jié)合特異性。

那么一個(gè)顯而易見的問題是：為什么RBP已經(jīng)演變?yōu)橐蕾囉谏舷挛奶卣鞫皇莾H僅賦予它們不同的主題?

可訪問性似乎是更合理的論據(jù)之一。研究人員推斷線性RNA片段在物理上更容易到達(dá)，因?yàn)樗鼈儾皇芷渌鸕NA鏈的阻礙，并且他們發(fā)現(xiàn)更容易接近的圖案更容易受到限制。另一種可能性是，使許多蛋白質(zhì)靶向相同的基序會(huì)產(chǎn)生一些蛋白質(zhì)間的競(jìng)爭(zhēng)。如果一種蛋白質(zhì)增加RNA穩(wěn)定性而另一種蛋白質(zhì)降低它，那么結(jié)合最強(qiáng)的蛋白質(zhì)將阻止另一種蛋白質(zhì)完全結(jié)合，從而使細(xì)胞或細(xì)胞狀態(tài)之間的基因活性發(fā)生更明顯的變化。在其他情況下，具有靶向相同基序的相似功能的蛋白質(zhì)可提供冗余以確保在細(xì)胞中發(fā)生調(diào)節(jié)。

“這絕對(duì)是一個(gè)難題，而且我們可能永遠(yuǎn)無法回答這個(gè)問題，”多明格斯說。“由于RBP在進(jìn)化時(shí)間內(nèi)重復(fù)，可能改變對(duì)RNA基序周圍環(huán)境特征的識(shí)別比改變整個(gè)RNA基序更容易。這將為RBP選擇不同的細(xì)胞靶標(biāo)提供新的機(jī)會(huì)。”

該研究標(biāo)志著ENCODE項(xiàng)目的首批體外貢獻(xiàn)之一。雖然體內(nèi)試驗(yàn)揭示了特定細(xì)胞系或其進(jìn)行組織的特定信息，但RBNS將有助于確定RNA-蛋白質(zhì)相互作用的基本規(guī)則 - 因此它們很可能適用于許多細(xì)胞類型和組織。