萊斯大學的研究人員開發(fā)了一種計算模型來量化CRISPR-Cas9蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)其基因組編輯目標的機制?；瘜W和化學與生物分子工程的萊斯教授阿納托利科洛梅斯基和校友阿列克謝希弗特改編了他們之前開發(fā)的系統(tǒng)，以展示蛋白質(zhì)如何找到它們的生物靶標。他們希望修改后的模型能夠幫助解開CRISPR的其余奧秘。

在其天然狀態(tài)下，CRISPR代表“聚集有規(guī)律的間隔短回文重復序列”，是細菌保護自身免受病毒感染的生物學機制。這些細菌包含了一份外國DNA，并建立了所有入侵者的記錄。它們在檢測到新入侵者時引用該記錄并使用它來銷毀它們。

近年來，研究人員已開始調(diào)整基因組編輯中使用的機制，該機制有可能治愈疾病并增強包括人類在內(nèi)的生物體。但一個絆腳石的風險是CRISPR-Cas9蛋白(利用CRISPR方法的系統(tǒng)之一)將切割并替換錯誤的靶序列，引入突變。

生物物理雜志中描述的Rice模型發(fā)現(xiàn)，當允許這些脫靶編輯發(fā)生時，CRISPR-Cas9可能更有效地定位良好的靶標，因為蛋白質(zhì)不會浪費時間與脫靶相關以繼續(xù)搜索。

Kolomeisky說，這可能是也可能不是一件好事，但它肯定值得研究。“錯誤率(脫靶率)有時是10-20%，”他說。“我們有兩個想法：一個是病毒變異非?？?，也許細菌試圖削減只是稍微突變的目標，以便更靈活。另一個是有蛋白質(zhì)可以糾正錯誤，所以如果錯誤的削減并不多，系統(tǒng)可以容忍它們。

Kolomeisky說，他的模型是一個簡單的步驟，可以找出CRISPR編輯的動態(tài)。“CRISPR-Cas9是最受歡迎的變種，因為它只含有一種蛋白質(zhì)，在生物學上更容易使用，”他說。

萊斯實驗室開發(fā)了其原始模型，以了解蛋白質(zhì)如何沿著DNA滑動以找到目標并觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄等過程。Kolomeisky指出，CRISPR先驅(qū)Jennifer Doudna發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9不會以同樣的方式尋找。“她發(fā)現(xiàn)它不會在DNA的任何地方滑動，”他說。

相反，根據(jù)Doudna和她的團隊，蛋白質(zhì)最初識別三核苷酸PAM(用于原型間隔相鄰基序)序列，標記潛在靶標的位置。“CRISPR發(fā)現(xiàn)并結合PAM，然后其相關的RNA探索相鄰的DNA，看看它是否是目標，”Kolomeisky說。“如果是的話，蛋白質(zhì)會開始減少。如果沒有，它會解除分離，并在其他地方尋找。”

在Doudna隨后刪除PAM序列的實驗中，CRISPR-Cas9蛋白根本找不到它們的靶標。因此，PAMs具有重要作用，而不僅僅是一個通用的間隔物，他說。“一旦我讀到這篇文章，我就知道我們也可以在這里使用我們的模型。”

理論模型著眼于第一次通過過程 - 當系統(tǒng)超過物理或化學閾值時發(fā)生的那些過程，例如找到相關的PAM來跟蹤插入到細胞中的CRISPR-Cas9蛋白，因為它們首先調(diào)查PAM序列，然后結合到PAMs，搜索與Cas9 RNA相匹配的DNA靶標。

他們發(fā)現(xiàn)，通過與“錯誤的”DNA分離而避免脫靶的切割的CRISPR比需要更長時間定位的CRISPR比僅僅切斷目標的更長。“走向錯誤的PAM需要時間，”Kolomeisky說。“我們的計算結果表明，當有時候切入錯誤的地方時，CRISPR可以更快找到真正的目標。進入正確目標的部分可能會更小，但最終會削減它們。

“這是一個簡單的模型，完全可以解決，”Kolomeisky說。“如果有人想測試，該模型可以提供具體的預測，并在某些情況下提供應該觀察的趨勢。” 模型中遺漏的是能夠看到RNA密鑰是否同時識別其靶標同時與DNA結合 - 或者依次與核苷酸核苷酸結合。

“關于CRISPR的最令人印象深刻的事情不是在細菌中發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)，而是在生物技術方面創(chuàng)造了一場革命，因為這意味著在任何細胞中我們都可以在特定位置切割任何DNA，非常精確，”科洛梅斯基說。“我希望我們的工作能夠激發(fā)更多的基礎研究，因為我非常喜歡CRISPR方法。但是當人們應用它而不理解它在分子水平上如何工作時，我感到不快樂。”

Shvets現(xiàn)在是麻省理工學院的博士后研究員。Kolomeisky是化學和化學與生物分子工程的教授。