金澤大學(xué)和東京大學(xué)的研究人員在Nature Communications上報(bào)告了“分子剪刀”動力學(xué)的可視化 - 這是CRISPR-Cas9基因工程技術(shù)的主要機(jī)制?；蚬こ讨惺褂玫募夹g(shù)之一 - 人工修飾生物體基因組的過程 - 涉及所謂的CRISPR-Cas9核酸酶系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)，可以在期望的位點(diǎn)切割細(xì)胞的DNA，其中可以刪除或添加基因。通過與Cas9蛋白結(jié)合的'指導(dǎo)RNA'分子來選擇待切割的位點(diǎn)。現(xiàn)在，由金澤大學(xué)的Mikihiro Shibata和東京大學(xué)的Osamu Nureki領(lǐng)導(dǎo)的研究小組已經(jīng)可視化了CRISPR-Cas9復(fù)合物的動態(tài)，特別是它如何切割DNA，為CRISPR-Cas9介導(dǎo)的DNA提供了寶貴的見解。解理機(jī)制。

對于他們的可視化研究，科學(xué)家們使用高速原子力顯微鏡(HS-AFM)，一種成像表面的方法。通過在其上移動微小的懸臂來探測表面; 探頭經(jīng)受的力可以轉(zhuǎn)換為高度測量值。然后掃描整個表面，得到樣品的高度圖。Shibata及其同事的高速實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)現(xiàn)了極快的重復(fù)掃描 - 可轉(zhuǎn)換成參與分子剪切作用的生物分子的電影。

首先，科學(xué)家們比較了沒有和附著RNA的Cas9(Cas9-RNA)。他們發(fā)現(xiàn)前者能夠靈活地采用各種構(gòu)象，而后者具有固定的雙葉結(jié)構(gòu)，突出了指導(dǎo)RNA的構(gòu)象穩(wěn)定能力。然后，Shibata及其同事研究了穩(wěn)定的Cas9-RNA復(fù)合物如何靶向DNA。他們證實(shí)它與DNA中預(yù)先選擇的原始間隔區(qū)相鄰基序(PAM)位點(diǎn)結(jié)合。PAM是位于DNA靶位點(diǎn)旁邊的短核苷酸序列，其與指導(dǎo)RNA互補(bǔ)。

研究小組的高速電影進(jìn)一步揭示了靶向('DNA詢問')是通過Cas9-RNA復(fù)合物的三維擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)的。最后，研究人員設(shè)法可視化切割過程本身的動力學(xué)：他們觀察了Cas9-RNA局部解開雙鏈DNA后，“分子剪刀”區(qū)域如何經(jīng)歷構(gòu)象波動(電影1 [URL])。Shibata的工作促進(jìn)了我們對CRISPR-Cas9基因組編輯機(jī)制的理解。用研究人員的話說：“...這項(xiàng)研究提供了關(guān)于CRISPR-Cas9功能動力學(xué)的前所未有的細(xì)節(jié)，并強(qiáng)調(diào)了HS-AFM可能闡明來自不同CRISPR-Cas系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)效應(yīng)核酸酶的作用機(jī)制。”

CRISPR-Cas9

CRISPR是“聚集的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列”的縮寫，是指一組細(xì)菌DNA序列，其含有早先攻擊細(xì)菌的病毒DNA片段。細(xì)菌使用這些片段來防止相同病毒的進(jìn)一步攻擊。“Cas”指CRISPR相關(guān)基因; “Cas9”是具有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域的CRISPR相關(guān)蛋白(核酸酶是能夠切割核酸，DNA和RNA中存在的有機(jī)分子的酶)。

近年來，開發(fā)了一種基因工程技術(shù)，其中CRISPR-Cas9復(fù)合物充當(dāng)“分子剪刀”; Cas9核酸酶與指導(dǎo)RNA分子結(jié)合，該分子包含有關(guān)靶位點(diǎn)DNA的信息。使用高速原子力顯微鏡，來自金澤大學(xué)的Mikihiro Shibata及其同事現(xiàn)在已經(jīng)非常詳細(xì)地研究了CRISPR-Cas9復(fù)合物的動力學(xué)。

原子力顯微鏡

原子力顯微鏡(AFM)是一種成像技術(shù)，其中通過用非常小的尖端掃描表面來形成圖像。尖端的水平掃描運(yùn)動通過壓電元件控制，而垂直運(yùn)動轉(zhuǎn)換為高度輪廓，從而產(chǎn)生樣品表面的高度分布。由于該技術(shù)不涉及透鏡，因此其分辨率不受所謂的衍射極限的限制。在高速設(shè)置中，AFM可用于實(shí)時(shí)生成樣本演變的電影。高速AFM已成功用于研究蛋白質(zhì)動力學(xué)，例如肌動蛋白V在肌動蛋白絲上行走，光誘導(dǎo)的細(xì)菌視紫紅質(zhì)構(gòu)象變化和纖維素降解。