約翰霍普金斯大學(xué)的科學(xué)家們開發(fā)了一種簡化的方法，并伴隨著使用稱為CRISPR的基因切割工具將新DNA序列引入細(xì)胞的效率“規(guī)則”?？茖W(xué)家們說，這種方法基于對小鼠胚胎和數(shù)千種人類細(xì)胞的測試，可以提高基因組編輯的一致性和效率。

新方法及其發(fā)展在11月28日的“美國國家科學(xué)院院刊”網(wǎng)絡(luò)版上有所描述。“CRISPR是一種幫助科學(xué)家修改基因組，預(yù)測某些特性的結(jié)果并研究它們的工具，但該工具本身只會在基因組中產(chǎn)生斷裂。它不能控制新DNA序列如何插入基因組中，” Geraldine Seydoux，博士，亨廷頓謝爾頓分子生物學(xué)和遺傳學(xué)系醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)教授，約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究副主任，以及霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員。“我們開始研究細(xì)胞如何修復(fù)由CRISPR誘導(dǎo)的斷裂，目的是利用細(xì)胞的天然DNA修復(fù)過程在基因組中引入新的序列。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞很容易從外源DNA復(fù)制序列來修復(fù)DNA斷裂，只要外國DNA是線性的，“Seydoux補(bǔ)充道。“通過研究在修復(fù)過程中如何復(fù)制外源DNA片段，我們提出了一些簡單的規(guī)則，使基因組編輯盡可能高效，優(yōu)化工具，并充滿信心地完成工作。”

作為有效切割DNA的工具，CRISPR在過去五年中在科學(xué)家中廣受歡迎，它代表了有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列。它適用于哺乳動物細(xì)胞，來自細(xì)菌細(xì)胞中的天然病毒防御過程，涉及在病毒DNA中產(chǎn)生致死性切割。從本質(zhì)上講，該工具是一套流線型的分子“剪刀”。

科學(xué)家們普遍認(rèn)為，細(xì)胞通過插入一組隨機(jī)核苷酸(DNA的化學(xué)構(gòu)建塊)來修復(fù)DNA斷裂。這通常會破壞位于DNA斷裂點(diǎn)的任何基因。科學(xué)家們也熟知，有時，細(xì)胞使用不同的來源 - 來自另一片DNA的序列，或“供體”DNA來密封DNA的斷裂。然而，新的“供體”序列不能自身插入基因組中的空白空間。相反，新的供體DNA需要在每一端都有一種膠帶，以幫助它粘在切口所形成的間隙內(nèi)?？茖W(xué)家將這種膠帶稱為供體DNA的“同源”臂。

同源臂由與DNA的完整部分重疊的核苷酸組成，具有匹配的遺傳密碼。這有助于供體DNA“粘附”到完整的DNA上。然而，科學(xué)家認(rèn)為使用供體DNA作為修復(fù)基因組的低效方法，假設(shè)它需要長同源臂，特別是當(dāng)插入長DNA序列時，以及單鏈或環(huán)狀DNA，這些很難用于長尺寸。隨著科學(xué)家們獲得更多的CRISPR經(jīng)驗(yàn)，Seydoux說：“有關(guān)供體DNA的最佳設(shè)計(jì)規(guī)則和同源臂長度的問題出現(xiàn)了。”

為了尋找這些問題的答案，約翰霍普金斯大學(xué)的科學(xué)家將供體DNA的各種組合插入到人類胚胎腎細(xì)胞中，這些細(xì)胞以其良好的生長能力和頻繁用于癌癥研究而聞名?？茖W(xué)家使用供體DNA和一個編碼熒光蛋白的基因，當(dāng)基因插入成功時，熒光蛋白在細(xì)胞核膜上發(fā)出綠光。

約翰霍普金斯大學(xué)的研究員Alexandre Paix發(fā)現(xiàn)線性DNA片段作為供體非常有效，并且比人類細(xì)胞中的環(huán)狀DNA(稱為質(zhì)粒)效率高2到5倍。“線性DNA很容易在實(shí)驗(yàn)室中使用PCR進(jìn)行制備，”Paix說，他指的是用于擴(kuò)增DNA的聚合酶鏈反應(yīng)工具。

Paix還測試了不同長度的同源臂。他發(fā)現(xiàn)同源臂的最佳位置長度約為35個核苷酸，比科學(xué)家通常使用的短得多。具體而言，發(fā)現(xiàn)長度為33至38個核苷酸的同源臂與具有518個核苷酸的同源臂一樣成功，在最佳條件下產(chǎn)生10%至20%的成功編輯。相反，當(dāng)科學(xué)家測試長度為15和16個核苷酸的同源臂時，插入成功率下降了一半。他們在人類基因組的三個不同位置重復(fù)這些結(jié)果。

他們還發(fā)現(xiàn)，新插入的序列，不包括同源臂，長度可達(dá)1000個核苷酸。

該團(tuán)隊(duì)的成功率在10%至5??0%之間，插入片段的長度范圍為57至993個核苷酸。較短的序列比較長的序列更成功插入。例如，分別在45.4%，23.5%和17.9%的時間內(nèi)成功插入長度為57,714和993個核苷酸的新序列。超過1,000個核苷酸，具有1,122和2,229個核苷酸的新插入物幾乎沒有成功 - 約0.5%的時間。“在這樣的規(guī)模下，引入編輯所需的供體 DNA 數(shù)量變得非常困難。細(xì)胞傾向于”扼殺“如此多的DNA，”Seydoux說。

最后，研究小組還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)新序列位于距離CRISPR切割位點(diǎn)30個核苷酸內(nèi)時，編輯成功率達(dá)到峰值。“超過30個核苷酸，插入是不可行的，”Seydoux說。“這些參數(shù)應(yīng)該適應(yīng)科學(xué)家正在尋求編輯的大多數(shù)基因。事實(shí)上，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)只涉及編輯靠近CRISPR切割位點(diǎn)的2-3個核苷酸，”Seydoux補(bǔ)充道。

研究小組還測試了相同的方法是否適用于小鼠胚胎。使用具有36 個核苷酸同源臂的PCR片段，該團(tuán)隊(duì)成功地將編碼熒光蛋白的739個核苷酸長的序列插入到87個(31%)小鼠胚胎中的27個中。Seydoux的研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開始使用修復(fù)規(guī)則研究線蟲(Caenorhabditis elegans)中的DNA，這是一種蠕蟲，研究人員正在研究修復(fù)規(guī)則是否適用于其他類型的人體細(xì)胞。在指南被廣泛采用之前，Seydoux說它們應(yīng)該在更多的人類細(xì)胞類型和其他生物體中進(jìn)行測試。