光散射儀器廣泛用于表征溶液中的??大顆粒和納米顆粒。它提供了使用多角度光散射(MALS)，差示粘度測(cè)量，場(chǎng)流分級(jí)(FFF)，動(dòng)態(tài)光散射(DLS)，電泳遷移率和確定絕對(duì)摩爾質(zhì)量，大小，構(gòu)象，電荷和相互作用的尖端工具。成分漸變。

Wyatt在儀器和軟件方面的最新發(fā)展使FFF的全部潛力可以為更廣泛的用戶群所用。在這次采訪中，Kim R. Williams和Christoph Johann就新技術(shù)及其研究與新聞 - 醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)進(jìn)行了交流。

FFF最突出的特點(diǎn)是什么?我們?yōu)槭裁匆褂肍FF?

CJ：首先，我們應(yīng)該回顧一下FFF最突出的特點(diǎn)。FFF根據(jù)尺寸物理分離樣品，因此它允許我們收集餾分。使用Eclipse FFF系統(tǒng)，我們可以將實(shí)體從僅幾納米到幾微米的尺寸分開。此外，該技術(shù)溫和，施加低剪切力，并且是非破壞性的。

當(dāng)與MALS結(jié)合使用時(shí)，F(xiàn)FF特別有效，MALS提供洗脫級(jí)分的絕對(duì)摩爾質(zhì)量和大小。因?yàn)樗Y(jié)合了基于尺寸的分離和在線光散射，所以它具有比標(biāo)準(zhǔn)批量或未分級(jí)DLS更高的分辨率。

此外，我認(rèn)為支持離線方法開發(fā)的新SCOUT DPS軟件是一個(gè)令人興奮的附加功能。該軟件最大限度地減少了方法開發(fā)所需的實(shí)驗(yàn)數(shù)量。只需少量注射即可獲得最佳結(jié)果，而不是在實(shí)驗(yàn)室中花費(fèi)數(shù)小時(shí)。

從FFF實(shí)驗(yàn)中獲得什么類型的數(shù)據(jù)?

CJ：我們可以從每個(gè)洗脫體積的多角度光散射分析中獲得絕對(duì)摩爾質(zhì)量和RMS半徑的詳細(xì)分布。此外，我們可以通過動(dòng)態(tài)光散射計(jì)算每個(gè)洗脫體積的流體動(dòng)力學(xué)半徑，或者從FFF保留時(shí)間得出它。

對(duì)于大分子，濃度來自UV或折射率檢測(cè)器以獲得定量分布，而對(duì)于納米顆粒，顆粒濃度的分布僅通過光散射來量化。

您如何確保蛋白質(zhì)不與AF4膜相互作用?

KRW：重要的是驗(yàn)證蛋白質(zhì)與AF4中使用的膜之間沒有相互作用，特別是當(dāng)AF4用于從保留時(shí)間計(jì)算粒徑時(shí)。

我認(rèn)為在沒有交叉流動(dòng)的情況下進(jìn)行初始運(yùn)行總是明智的，以確保注入足夠的樣品并且在檢測(cè)器中獲得非常大的峰值。如果您發(fā)現(xiàn)自己處于完全樣品丟失的嚴(yán)重情況，您可以通過降低場(chǎng)強(qiáng)或交叉流速來糾正它。

通過預(yù)處理膜，例如通過注入蛋白質(zhì)溶液，或通過減少鹽負(fù)荷，也可以減少相互作用。我發(fā)現(xiàn)50毫摩爾氯化鈉溶液，甚至沒有加入鹽的磷酸鹽緩沖液都可以提高FFF的分辨率和回收率。您不必總是使用含有150毫摩爾氯化鈉的PBS緩沖液，這在體積排阻色譜MALS中很常見。

你能描述Eclipse FFF嗎?

CJ：我認(rèn)為最重要的是Eclipse FFF易于使用，同時(shí)又是一個(gè)強(qiáng)大而強(qiáng)大的系統(tǒng)。它結(jié)合了三個(gè)關(guān)鍵特性：無縫集成; 完整系統(tǒng)的完全自動(dòng)化和廣泛的數(shù)據(jù)處理能力。

能夠使用新的VISION CSH軟件平臺(tái)將完整的工作流程從方法開發(fā)集成到最終結(jié)果非常棒。這包括用于儀器控制和運(yùn)行實(shí)驗(yàn)的VOYAGER CDS應(yīng)用程序以及用于數(shù)據(jù)處理和方法開發(fā)的SCOUT DPS應(yīng)用程序。

我希望我們?cè)趦x器和軟件方面的新發(fā)展將使更多用戶能夠獲得FFF的全部潛力。

如何使用SCOUT進(jìn)行方法開發(fā)?

CJ：SCOUT幫助我們選擇正確的流程來實(shí)現(xiàn)理想的分離。我們只需要將我們想要的通道幾何形狀和假定的樣品粒度范圍輸入到SCOUT中，建立一個(gè)標(biāo)稱流程序，并且通過它可以直接給出一個(gè)預(yù)測(cè)的分形圖。

流程程序包括通道流速和橫流速率隨時(shí)間的演變。預(yù)計(jì)的峰值立即顯示其計(jì)算的保留時(shí)間，并且它還給出了峰值稀釋度。我們可以更改參數(shù)，例如通道長度或流速，以查看效果。這一切都很快就由軟件決定，為我們節(jié)省了大量的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，SCOUT預(yù)測(cè)非常準(zhǔn)確，并且緊跟實(shí)際實(shí)驗(yàn)的UV痕跡。

通過這種方式，我們可以直接找到一種能夠提供合適分辨率的方法。一旦我們選擇了合適的方法，我們就可以將它導(dǎo)出到VOYAGER，它將運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。

FFF如何幫助了解抗體的聚集動(dòng)力學(xué)?分析生物藥物有哪些挑戰(zhàn)?

KRW：常規(guī)藥物通常是配制成膠囊的小分子，具有較長的保質(zhì)期。相比之下，生物治療藥物或生物藥物是形態(tài)上異質(zhì)的大型復(fù)雜分子。

它們?cè)谌芤褐信渲撇⑼ㄟ^注射器注射或靜脈內(nèi)輸注施用。與他們的分析相關(guān)的主要挑戰(zhàn)源于他們往往不穩(wěn)定且對(duì)壓力敏感的事實(shí)。

因此，對(duì)我們來說，使用不會(huì)使生物藥物降解或變性的分析過程非常重要。有多個(gè)加工步驟和應(yīng)激源可導(dǎo)致不可逆的變性，例如溫度，pH和溶液組成。

如果抗體單體變性，則發(fā)生聚集和沉淀，這將在注射入患者時(shí)降低其功效并增加其免疫原性的可能性。區(qū)分這些蛋白質(zhì)聚集體和可能的外來污染物也很重要，例如硅油微滴，氣泡，甚至玻璃碎片或橡膠碎片。

哪種技術(shù)可用于表征蛋白質(zhì)聚集體?

KRW：使用的技術(shù)實(shí)際上取決于蛋白質(zhì)的大小。對(duì)于超過一微米的蛋白質(zhì)，存在幾種技術(shù)，但是用于分析納米至一微米范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的技術(shù)非常少。

尺寸排阻色譜(SEC)是目前最常用于觀察蛋白質(zhì)聚集體的方法，但它并不理想。首先，流動(dòng)相組成是有限的，這最大限度地減少了柱填料表面上的吸收。其次，可用的孔徑限制了每個(gè)柱可以分離的尺寸范圍。

第三，填充柱將導(dǎo)致剪切降解，這在研究瞬態(tài)聚集體時(shí)尤其成問題。最后，為避免色譜柱堵塞，通常會(huì)對(duì)樣品進(jìn)行過濾或超離心分離，并且不知道在此過程中是否清除了哪些樣品。

我們開發(fā)了一種基于非對(duì)稱流動(dòng)FFF(AF4)和光散射的簡單方法，以滿足對(duì)SEC中丟失物質(zhì)的信息的需求：較大的聚集體或在柱上經(jīng)受剪切的聚集體。它使我們能夠獲得亞微米蛋白質(zhì)聚集體的信息。

您能告訴我們更多關(guān)于這種方法的優(yōu)點(diǎn)嗎?

KRW：不對(duì)稱流動(dòng)FFF涉及在沒有填料的情況下在開放通道中分離組分。垂直于分離軸施加場(chǎng)以形成交叉流動(dòng)。使用開放通道可以在很寬的尺寸范圍內(nèi)進(jìn)行分離，范圍從1納米到數(shù)十微米。然而，我們發(fā)現(xiàn)它對(duì)于10 4至大于10 8道爾頓范圍內(nèi)的大分子表現(xiàn)最佳。

關(guān)于載液的選擇存在很大的靈活性，因?yàn)榕c分離表面的相互作用較少。

此外，我們發(fā)現(xiàn)通過調(diào)整交叉流速可以輕松調(diào)整分離，這反過來會(huì)改變場(chǎng)強(qiáng)，然后改變保留時(shí)間。

當(dāng)分析100納米及以上的較大分析物(包括抗體聚集體)時(shí)，AF4優(yōu)于尺寸排阻色譜法。

那么它如何與光散射技術(shù)相結(jié)合呢?

KRW：AF4中的保留時(shí)間可以與平移擴(kuò)散系數(shù)相關(guān)，而平移擴(kuò)散系數(shù)又可以使用斯托克斯 - 愛因斯坦方程與流體動(dòng)力學(xué)半徑相關(guān)。從本質(zhì)上講，AF4基于流體動(dòng)力學(xué)尺寸實(shí)現(xiàn)了分離。

一旦樣品通過AF4進(jìn)行了尺寸分離，它們就會(huì)暴露在在線光散射檢測(cè)器中。如果使用多角度光散射(MALS)檢測(cè)器，則可以獲得摩爾質(zhì)量和均方根半徑的測(cè)量值。如果使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)器，則可以測(cè)量平移擴(kuò)散系數(shù)，由此可以使用斯托克斯愛因斯坦方程計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)半徑。

AF4和光散射是具有重要協(xié)同能力的互補(bǔ)技術(shù)。AF4能夠取出多相多分散樣品并將其分離成單分散的部分。然后，MALS和DLS提供摩爾質(zhì)量和尺寸的正交測(cè)量?？梢詫⑦@些值與使用AF4理論計(jì)算的AF4值進(jìn)行比較。

AF4 MALS如何用于研究蛋白質(zhì)聚集動(dòng)力學(xué)?

KRW：形成蛋白質(zhì)聚集體有四個(gè)基本階段。階段1是與另一種反應(yīng)性單體的部分展開和可逆締合; 第2階段是不可逆的聚集核形成; 階段3是鏈聚合; 第4階段是聚合凝結(jié)。最終結(jié)果是形成可溶性高摩爾質(zhì)量的亞微米物質(zhì)，這正是我們?cè)噲D表征的

Lumry-Eyring有核聚合(LENP)聚集模型提供了比以前的模型更全面的非天然聚集動(dòng)力學(xué)的定量描述，因?yàn)樗羞@些不同的階段。LENP模型評(píng)估三種不同的時(shí)間尺度：成核時(shí)間(t n); 改變聚合的時(shí)間(t g); 和凝結(jié)時(shí)間(t c)。

使用一系列微分方程，如果單體分?jǐn)?shù)和聚集體的摩爾質(zhì)量可以確定為時(shí)間的函數(shù)，則可以確定t n，t g和t c。這可以通過AF4和MALS實(shí)現(xiàn)。

當(dāng)我們將該技術(shù)應(yīng)用于抗鏈霉抗生物素蛋白IgG1樣品時(shí)，我們看到了兩個(gè)峰。第一個(gè)峰出現(xiàn)在7.5分鐘，這是150千道爾頓單體(相當(dāng)于抗鏈霉抗生物素蛋白IgG1的摩爾質(zhì)量)。我們?cè)诖蠹s9分鐘后看到的第二個(gè)峰值是聚合物。因此，我們?cè)O(shè)法分離單體和聚集體。

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監(jiān)測(cè)這些峰的大小使我們能夠研究應(yīng)激(例如熱)對(duì)被監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的影響。沒有加熱，150千道爾頓單體只有一個(gè)峰。當(dāng)施加熱量時(shí)，我們看到聚集峰出現(xiàn)并且隨著時(shí)間的推移其尺寸增加，因?yàn)楦嗟牡鞍踪|(zhì)通過暴露于熱量而變性。然后將單體峰的大小作為應(yīng)力時(shí)間的函數(shù)作圖。來自AF4-MALS的數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示隨著應(yīng)力時(shí)間增加單體損失增加。然后，從擬合線，我們可以確定t n，t c和t g的值。

通過這種方式，使用AF4和MALS分析，我們已經(jīng)證明離心樣品是尺寸排阻色譜之前的常見做法，它改變了每個(gè)步驟的時(shí)間尺度：成核步驟，鏈聚合步驟和聚集縮合步驟。在抗鏈霉抗生物素蛋白IgG1的情況下，該變化不足以改變聚集的動(dòng)力學(xué)。

AF4分離對(duì)蛋白質(zhì)聚集體有何影響?

KRW：我們?cè)跓釕?yīng)激后和加入檸檬酸后使用FFF評(píng)估了蛋白質(zhì)聚集體的穩(wěn)定性。我們可以跟蹤樣本隨時(shí)間的變化程度。

我們發(fā)現(xiàn)AF4聚焦步驟沒有產(chǎn)生抗鏈霉抗生物素蛋白IgG1聚集體。然而，載體液體組合物確實(shí)影響聚集體穩(wěn)定性，并且在稀釋期間傾向于發(fā)生聚集體締合。

AF4中的稀釋主要發(fā)生在通道出口處，而不是在分離過程中。與尺寸排阻色譜法相比，這可以為分離濃度敏感的分析物提供更寬容的條件。

AF4和尺寸排阻色譜MALS如何比較蛋白質(zhì)聚集研究?

KRW尺寸排阻色譜和AF4是基于互補(bǔ)尺寸的分離技術(shù)。尺寸排阻色譜法對(duì)于小型低聚物具有更好的分辨率，而AF4更適合分析高級(jí)摩爾質(zhì)量聚集體，尤其是那些易于產(chǎn)生剪切應(yīng)力的聚集體。

定性動(dòng)力學(xué)研究表明，AF4甚至可以達(dá)到20微米的聚集體，這是尺寸排阻色譜法無法實(shí)現(xiàn)的尺寸范圍。

我們相信AF4 MALS可以提供??動(dòng)力學(xué)機(jī)制的重要見解，并能夠研究聚集體的穩(wěn)定性。