帶磁性的核在外加磁場中會(huì)產(chǎn)生能級裂分，吸收對應(yīng)波長的電磁波就會(huì)發(fā)生能級的躍遷，停止電磁波照射后通過自旋晶格弛豫回到平衡態(tài)，產(chǎn)生核磁共振效應(yīng)。經(jīng)過核磁共振科學(xué)家多年不懈的努力后，二維核磁技術(shù)終于在20世紀(jì)70年代開始走向成熟，走向應(yīng)用，典型的有同核COSY、DQF-COSY、TOESY、NOESY、ROESY技術(shù)，異核HMQC、HMSC、HSQC技術(shù)，另外還有研究核與核之間相互作用的NOE技術(shù)。新藥發(fā)現(xiàn)的一個(gè)主要途徑是化合物文庫和天然化合物的的篩選以及為了活性性質(zhì)優(yōu)化的大量結(jié)構(gòu)類似化合物的合成。這些過程耗費(fèi)大量人力物力，而且風(fēng)險(xiǎn)還很高，而這些技術(shù)為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用帶來了極大的便利。從20世紀(jì)末核磁共振技術(shù)首次成功運(yùn)用于先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)過程開始，一場新的藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)革命悄然誕生。以下我們主要介紹核磁共振技術(shù)在先導(dǎo)化合物篩選過程中的開創(chuàng)性應(yīng)用實(shí)例。

01、FK506結(jié)合蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)

FK506結(jié)合蛋白和FK506結(jié)合，抑制鈣調(diào)磷酸酶和阻止T細(xì)胞活化，為了尋找FK506和結(jié)合蛋白結(jié)合的抑制劑，F(xiàn)esik等人避開了傳統(tǒng)的篩選路徑，開發(fā)了一套嶄新的藥物先導(dǎo)化合物篩選發(fā)現(xiàn)途徑，

上圖A是靶標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，通過第一輪小分子化合物配體篩選得到B，小分子與蛋白的結(jié)合作用可以通過N同位素標(biāo)記的HSQC技術(shù)觀察酰胺質(zhì)子和氮原子的化學(xué)位移來識(shí)別，由于蛋白是N同位素標(biāo)記，而化合物沒有進(jìn)行N同位素標(biāo)記所以小分子底物不會(huì)干擾蛋白化學(xué)位移信號(hào)，從而提高了信噪比。第一個(gè)配體得到后經(jīng)過一系列的藥物化學(xué)修飾得到優(yōu)化后的C，下面的目標(biāo)則是尋找結(jié)合蛋白相鄰位點(diǎn)的配體，確定的依據(jù)仍是核磁譜圖中化學(xué)位移變化的相關(guān)情況，第二個(gè)配體粗選后繼續(xù)經(jīng)過藥物化學(xué)的修飾得到活性最高的小分子化合物如上圖E。在兩個(gè)先導(dǎo)配體被選定后，通過核磁共振或者X-射線衍射技術(shù)得到三元復(fù)合物在空間的相對位置和小分子配體的空間取向，通過設(shè)計(jì)合適的連接子將兩個(gè)配體片段連接起來得到最后的先導(dǎo)化合物如圖上圖F。

在FK506結(jié)合蛋白的抑制劑篩選過程中，第一輪篩選發(fā)現(xiàn)化合物文庫發(fā)現(xiàn)如下圖化合物1具有最高的活性，化合物1不經(jīng)過進(jìn)一輪的優(yōu)化作為第一個(gè)配體，可以通過酰胺化學(xué)位移的變化斷定化合物1的結(jié)合位置和FK506哌啶酸部分的結(jié)合位置一致。在化合物1飽和的條件下，繼續(xù)尋找與相鄰結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的小分子配體，通過對化合物庫的篩選初步得到化合物2具有一定的活性，通過對在化合物1飽和的情況下化合物2加入后化學(xué)位移的變化，可以斷定化合物2和化合物1的結(jié)合位點(diǎn)相近。

化合物2經(jīng)過經(jīng)過進(jìn)一輪的構(gòu)效關(guān)系研究得到最終高活性的化合物3。

通過基于同位素濾波核磁共振試驗(yàn)建立三元復(fù)合物的空間模型，化合物1的甲酯結(jié)構(gòu)和化合物3的苯環(huán)上的羥基結(jié)構(gòu)在空間位置上比較接近，設(shè)計(jì)連接子跨過空間連接兩個(gè)小分子配體，要保證設(shè)計(jì)的連接子不影響小分子配體在空間的位置和結(jié)構(gòu)取向，設(shè)計(jì)如下圖的分子結(jié)構(gòu)。

最終結(jié)果顯示化合物10具有最高的活性，化合物14的分子式如下圖，它采用了另一種連接方式，活性也達(dá)到了49nM。

為了觀察兩個(gè)小分子配體在連接之前和連接之后與結(jié)合蛋白的結(jié)合作用部位的變化，分別進(jìn)行NOE研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1和化合物14的哌啶酸部分和三甲氧基苯基部分結(jié)合部位一樣，與蛋白形成疏水相互作用，另外化合物3與化合物14的結(jié)合位置相似，化合物3的苯甲酰環(huán)與蛋白中Gln53，IIe56，Arg57的相互作用在化合物14與蛋白的相互作用中沒看到，這又說明了盡管二者作用位點(diǎn)相似，但連接子的引入確實(shí)影響了化學(xué)位移的變化。

從以上的實(shí)驗(yàn)可以看出化合物1的Kd=2uM，化合物3的Kd=0.1mM，當(dāng)利用連接子巧妙地連接兩個(gè)小分子配體后，得到的化合物活性都在nM級別。兩個(gè)配體可通過不同的連結(jié)子(linker)連接起來，這種連接可以從焓變和熵變對結(jié)合能的貢獻(xiàn)上得到理論支持[3]，這使得先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率實(shí)現(xiàn)了一個(gè)質(zhì)的飛越。

02、質(zhì)溶解素(MMP-3)非肽類抑制劑先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴的家族內(nèi)切蛋白酶，包括膠原酶，明膠酶和基質(zhì)溶解素。該酶家族參與基質(zhì)降解和組織重塑，并且當(dāng)過表達(dá)或失調(diào)時(shí)與關(guān)節(jié)炎和腫瘤轉(zhuǎn)移等病癥相關(guān)。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了基于底物特異性設(shè)計(jì)的有效的基于肽的抑制劑，但是許多這些化合物表現(xiàn)出差的生物利用度。已發(fā)現(xiàn)幾種非肽天然產(chǎn)物可抑制這類酶，如聚天冬氨酸和四環(huán)素衍生物。然而，這些化合物僅表現(xiàn)出中等的抑制活性。利用核磁共振技術(shù)S. W. Fesik等人成功的找到了對基質(zhì)溶解素活性很高的先導(dǎo)化合物。

由于許多已知的MMP抑制劑含有異羥肟酸部分，用HSQC譜方法從化合物庫中篩選到乙酰羥胺(CH3CONHOH)對基質(zhì)溶酶的親和力很弱，Kd=17mM，由于它的分子較小以及在緩沖液中的溶解度較大(大于500mM)，未作任何優(yōu)化選作第一配體。

在飽和量的乙酰羥胺存在下，用HSQC譜方法發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯及其類似物可以結(jié)合基質(zhì)溶酶Kd在mM范圍，經(jīng)過近40余個(gè)聯(lián)苯化合物的結(jié)構(gòu)-活性研究比較(如下圖)，發(fā)現(xiàn)3'-氰甲基-4-羥基聯(lián)苯(26)與基質(zhì)溶酶的親合力Kd達(dá)0.02mM。

通過對乙酰羥胺，3'-氰甲基-4-羥基聯(lián)苯類似物以及基質(zhì)溶酶的三元配合物的NMR研究，設(shè)計(jì)合成了11個(gè)化合物(45～55)，生物活性實(shí)驗(yàn)證明，與原有單體化合物相比，所有化合物的活性均有增強(qiáng)。對基質(zhì)溶酶最具抑制活性的化合物50和53其IC50分別為25和15nM，活性增強(qiáng)近千倍。

03、“SAR by NMR”和組合化學(xué)的對比

“SAR by NMR”方法在概念上類似于組合化學(xué)，然而這兩種方法有本質(zhì)的區(qū)別，在組合化學(xué)中發(fā)現(xiàn)配體需要制備測試大量的化合物，不幸的是，合成方案的選擇和生物測定往往既困難又費(fèi)時(shí)，進(jìn)而相對統(tǒng)一的條件需要限制了有用的分子構(gòu)建模塊及化合物的多樣性。在“SAR by NMR”方法中，配體已預(yù)選進(jìn)行了優(yōu)化，所以只需合成少數(shù)幾個(gè)化合物即可。另一方面“SAR by NMR”方法不同于組合化學(xué)，篩選小分子化合物的范圍僅僅受到水溶解度達(dá)mM濃度的限制，結(jié)果可以收集到多種多樣的化合物樣品[5]。

總結(jié)

我們介紹了核磁共振技術(shù)在新藥研發(fā)先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中的運(yùn)用，需要注意的是以上這種核磁共振技術(shù)需要大量15N同位素標(biāo)記的結(jié)合蛋白，另外結(jié)合蛋白的分子量大都在40KD以下等一系列技術(shù)限制，不過可喜的是目前已經(jīng)開發(fā)出了兩種不需要15N標(biāo)記蛋白的新方法-一維馳豫編輯和擴(kuò)散編輯NMR方法[6]，彌補(bǔ)了這種方法的不足。

SPA(閃爍分析法)存在著放射性污染的環(huán)保問題，熒光分析法存在著底物濃度效應(yīng)，熒光猝滅效應(yīng)，化合物自身熒光干擾等問題，高通量篩選過程中會(huì)出現(xiàn)假陽性、假陰性，自動(dòng)化程度高可是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率低，而計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)則存在著力場選擇簡單，計(jì)算過程繁瑣，與現(xiàn)實(shí)情況符合性存疑等問題。新藥研發(fā)的技術(shù)變革從未止步，相信隨著核磁共振技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，必將繼續(xù)提高先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)效率，使得整個(gè)新藥研發(fā)周期縮短。