基因組學(xué)專家正在尋找新方法來(lái)改善Cas9酶在CRISPR基因編輯中的應(yīng)用，以減少脫靶突變的可能性。這項(xiàng)研究解決了對(duì)脫靶誘變的擔(dān)憂，并確定了提高精確度的新方法，該研究最近在休斯敦舉行的美國(guó)人類遺傳學(xué)會(huì) 2019年年會(huì)上發(fā)表。

什么是Cas9?

基因組或基因編輯使科學(xué)家能夠通過(guò)在基因組中特定位置添加，去除或改變遺傳物質(zhì)來(lái)改變生物體的DNA。一個(gè)在實(shí)驗(yàn)室中使用的更近的基因編輯技術(shù)是CRISPR-Cas9。

研究人員創(chuàng)建了一條帶有短“指導(dǎo)”序列的RNA，該序列可以識(shí)別并結(jié)合特定的靶DNA序列。指導(dǎo)RNA還與酶Cas9結(jié)合，后者又與靶DNA結(jié)合并在預(yù)期位置切割。一旦切割了DNA，研究人員就可以添加或刪除遺傳材料，或通過(guò)用定制的DNA序列替換DNA片段來(lái)對(duì)其進(jìn)行更改。

多倫多現(xiàn)象基因組學(xué)中心的副主任Lauryl Nutter和多機(jī)構(gòu)敲除小鼠表型研究計(jì)劃(KOMP2)的合作者經(jīng)常使用Cas9基因編輯來(lái)生成具有特定突變的小鼠品系。

在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行這種基因編輯過(guò)程時(shí)，他們常常想知道脫靶誘變的風(fēng)險(xiǎn)是什么–將意外的基因突變引入其小鼠品系。

“我們想知道：我們需要在多大程度上擔(dān)心脫靶誘變?” 納特說(shuō)。

改善人類基因編輯

研究小組希望，如果他們能夠確定小鼠問(wèn)題的嚴(yán)重程度，那么將有助于他們更好地評(píng)估人類細(xì)胞系中的問(wèn)題，并找到新的方法來(lái)提高基于Cas9的基因編輯的準(zhǔn)確性。

為了進(jìn)行調(diào)查，Nutter及其團(tuán)隊(duì)使用Cas9進(jìn)行了58個(gè)基因組編輯實(shí)驗(yàn)，并指導(dǎo)RNA誘導(dǎo)特定的靶向基因突變。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用2至4個(gè)向?qū)В偣苍黾恿?75個(gè)不同的向?qū)NA。

研究人員對(duì)每只小鼠進(jìn)行了全基因組測(cè)序，以檢查其靶標(biāo)之外的任何突變。

為了獲得基線突變率，將Cas9處理的小鼠品系的基因組與25只未處理的對(duì)照小鼠的基因組進(jìn)行了比較。在31個(gè)Cas9小鼠品系中，未發(fā)現(xiàn)脫靶突變，但在其余20個(gè)品系中平均鑒定出2.3個(gè)此類突變。

但是，在用Cas9處理和未處理的小鼠細(xì)胞系中，研究小組發(fā)現(xiàn)每只動(dòng)物平均有3500個(gè)自然發(fā)生的突變。

令人驚訝的是，這些結(jié)果表明，自然發(fā)生的突變數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了Cas9引入的突變數(shù)量。他們還表明，正確設(shè)計(jì)指導(dǎo)RNA時(shí)，脫靶誘變非常罕見(jiàn)。

研究結(jié)果為近交實(shí)驗(yàn)小鼠的使用增添了背景

這些發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)了對(duì)近交實(shí)驗(yàn)室小鼠在遺傳學(xué)研究中用途的理解，并為研究人員在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)所做的假設(shè)增添了背景。

從歷史上看，我們使用自交系小鼠來(lái)研究小鼠的遺傳學(xué)，因?yàn)樗鼈兊幕蚪M僅在某些特定的位置存在差異，并且我們已經(jīng)假定小鼠之間的任何差異都是由于這些差異引起的。但是，我們發(fā)現(xiàn)，即使在同一窩的小鼠中，也可能存在成千上萬(wàn)的自然遺傳差異。”

納特說(shuō)，研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了需要意識(shí)到在基因組中使用Cas9和其他工具的認(rèn)識(shí)可能沒(méi)有以前想象的那么好。

接下來(lái)，研究人員計(jì)劃研究抑制或增強(qiáng)DNA修復(fù)的酶是否會(huì)影響新突變發(fā)生的速率。他們還打算評(píng)估在增強(qiáng)Cas9誘變效率和提高其準(zhǔn)確性之間的權(quán)衡。

Nutter及其小組希望他們的發(fā)現(xiàn)將有助于導(dǎo)致更好的指導(dǎo)RNA的發(fā)展，以及對(duì)對(duì)照組的改進(jìn)使用和對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的更全面的了解。

研究小組指出，這種改進(jìn)的知識(shí)在具有潛在治療應(yīng)用的基因編輯研究中尤其重要，包括對(duì)基于基因療法的安全性和有效性的研究。