哈佛醫(yī)學院和康奈爾大學的科學家已經(jīng)生成了CRISPR的近原子分辨率快照，揭示了其作用機制的關(guān)鍵步驟。該研究結(jié)果于6月29日發(fā)表在Cell上，為改善CRISPR生物醫(yī)學應(yīng)用的效率和準確性提供了必要的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

通過冷凍電子顯微鏡，研究人員首次描述了確切的事件鏈，因為CRISPR復(fù)合物加載靶DNA并準備用于切割Cas3酶。研究人員說，這些結(jié)構(gòu)揭示了一個具有多層錯誤檢測的過程 - 一種分子冗余，可以防止意外的基因組損傷。

CRISPR-Cas3是CRISPR-Cas系統(tǒng)的亞型，是生物醫(yī)學研究中用于精確基因編輯的廣泛采用的分子工具。然而，其作用機制的方面，特別是它如何搜索其DNA靶標，尚不清楚，并且對非預(yù)期的脫靶效應(yīng)的擔憂引起了對用于治療人類疾病的CRISPR-Cas安全性的質(zhì)疑。

這些結(jié)構(gòu)的高分辨率細節(jié)揭示了使用CRISPR進行基因編輯時確保準確性和避免脫靶效應(yīng)的方法。

“為了解決特異性問題，我們需要了解CRISPR復(fù)合物形成的每一步，”哈佛醫(yī)學院細胞生物學助理教授，該研究的共同高級作者廖茂夫說。“我們的研究現(xiàn)在顯示了CRISPR如何從初始識別靶DNA和通過構(gòu)象變化過程捕獲入侵DNA的確切機制，這些變異使得DNA可被Cas3最終切割。”

目標搜索

在不到十年前發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas是一種適應(yīng)性防御機制，細菌用來抵御病毒入侵者。該過程涉及捕獲病毒DNA片段的細菌，然后將其整合到其基因組中并產(chǎn)生稱為crRNA(CRISPR RNA)的短RNA序列。這些crRNA片段用于發(fā)現(xiàn)“敵人”的存在。

像條形碼一樣，crRNA被加載到CRISPR家族酶的成員上，其執(zhí)行漫游細菌和監(jiān)測外國代碼的哨兵的功能。如果這些核蛋白復(fù)合物遇到與其crRNA相匹配的遺傳物質(zhì)，它們會切斷該DNA以使其無害。CRISPR-Cas亞型，特別是Cas9，可以用合成RNA編程，以便在精確位置切割基因組，使研究人員能夠以前所未有的方式編輯基因。

為了更好地理解CRISPR-Cas的功能，廖與康奈爾大學的Ailong Ke合作。他們的研究小組專注于1型CRISPR，這是細菌中最常見的亞型，它利用稱為CRISPR Cascade的核糖蛋白復(fù)合物進行DNA捕獲，使用Cas3酶切割外源DNA。

通過生物化學技術(shù)和低溫電子顯微鏡的結(jié)合，他們在不同的功能狀態(tài)下重建穩(wěn)定的Cascade，并進一步生成Cascade的快照，因為它捕獲并處理的DNA分辨率高達3.3埃 - 或大約是a的直徑的三倍。碳原子。

眼見為實

在CRISPR-Cas3中，crRNA被加載到CRISPR級聯(lián)上，其搜索稱為PAM的非常短的DNA序列，其指示外源病毒DNA的存在。

Liao，Ke和他們的同事發(fā)現(xiàn)，當Cascade檢測到PAM時，它會以銳角彎曲DNA，迫使一小部分DNA放松。這允許11個核苷酸的crRNA區(qū)段與一條靶DNA鏈結(jié)合，形成“種子泡”。

種子氣泡充當故障安全機制，以檢查目標DNA是否與crRNA匹配。如果它們正確匹配，則氣泡擴大并且crRNA的其余部分與其相應(yīng)的靶DNA結(jié)合，形成所謂的“R-環(huán)”結(jié)構(gòu)。

一旦R環(huán)完全形成，CRISPR級聯(lián)復(fù)合物經(jīng)歷構(gòu)象變化，將DNA鎖定到位。它還在第二個非目標DNA鏈中產(chǎn)生一個凸起，該鏈在Cascade復(fù)合體上的一個單獨位置上運行。

只有當形成完整的R-環(huán)狀態(tài)時，Cas3酶才會結(jié)合并切割在非靶DNA鏈中產(chǎn)生的凸起處的DNA。

研究結(jié)果揭示了精確的冗余，以確保精確度，避免錯誤地切碎細菌自身的DNA。

“為了在人類醫(yī)學中應(yīng)用CRISPR，我們必須確保該系統(tǒng)是準確的，并且它不針對錯誤的基因，”該研究的共同高級作者柯說。“我們的論點是CRISPR-Cas3亞型已經(jīng)發(fā)展成為一個精確的系統(tǒng)，有可能成為一個更準確的系統(tǒng)用于基因編輯。如果存在錯誤定位，我們知道如何操縱系統(tǒng)，因為我們知道所涉及的步驟以及我們可能需要干預(yù)的地方。“

設(shè)置景點

已經(jīng)描述了沒有靶DNA并且在其后R-環(huán)構(gòu)象狀態(tài)的CRISPR級聯(lián)的結(jié)構(gòu)，但是該研究首次揭示了從種子氣泡形成到高分辨率的R-環(huán)形成的全部事件序列。

與手術(shù)刀樣Cas9相比，CRISPR-Cas3就像一臺粉碎機，可以將DNA咀嚼到無法修復(fù)的狀態(tài)。雖然迄今為止CRISPR-Cas3對精確基因編輯的實用性有限，但它正在開發(fā)作為抗擊抗生素抗性細菌菌株的工具。更好地了解其機制可能會擴大CRISPR-Cas3的潛在應(yīng)用范圍。

此外，所有CRISPR-Cas亞型都利用某種形式的R-環(huán)形成來檢測和制備靶DNA以進行切割?，F(xiàn)在，對該過程的改進結(jié)構(gòu)理解使研究人員能夠努力修改多種類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，以提高其準確性并降低生物醫(yī)學應(yīng)用中脫靶效應(yīng)的可能性。

“科學家們假設(shè)這些狀態(tài)存在，但他們?nèi)狈σ曈X證明它們的存在，”共同第一作者Min Luo說，他是HMS遼實驗室的博士后研究員。“主要障礙來自于這些狀態(tài)的穩(wěn)定生化重建和高分辨率結(jié)構(gòu)可視化?，F(xiàn)在，看到真的相信。”

“我們發(fā)現(xiàn)這些步驟必須按照精確的順序進行，”羅說。“從進化上來說，這種機制非常嚴格，并具有三重冗余，以確保這種復(fù)合物僅降解入侵DNA。”