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      新的色譜技術(shù)可以提高我們對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的理解
      
			
      
				2019-03-13 10:51:59
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			  來源：
			
      
		
      
				
		
      
			
      由于它們同時表達(dá)，包膜病毒樣顆粒(VLP)和細(xì)胞外囊泡(EV)難以區(qū)分和分離用于分析目的。除了它們的共表達(dá)，EV和VLP表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)，生物物理學(xué)和分子相似性。為了解決這一分離挑戰(zhàn)，研究人員最近設(shè)計了一種兩步色譜法，可以分離VLPs和EV進(jìn)行精確分析。
      

      新的色譜技術(shù)可以提高我們對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的理解
      

      開發(fā)分離VLP和EV的方法的主要動機之一是進(jìn)一步了解HIV等逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。雖然確實存在病毒純化方法，例如密度梯度離心，超濾或尺寸排阻色譜，但這些方法在分離EV和VLP的能力方面證明是低效的。
      

      該新技術(shù)基于先前使用肝素親和層析作為分離VLP和EV的替代方法的工作。通常，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清液中高水平的肝素結(jié)合蛋白在該一步法中競爭結(jié)合位點。
      

      新的兩步法能夠在沒有任何競爭的情況下分離兩種顆粒。該研究可為大規(guī)模病毒學(xué)研究鋪平道路，研究EV和VLP的生物學(xué)作用。
      

      方法
      

      在Alois Jungbauer博士的帶領(lǐng)下，該研究的研究人員開發(fā)了一種兩步色譜純化技術(shù)，首先從HEK 293細(xì)胞中收集HIV-1 gag VLPs和EVs。然后處理細(xì)胞，收集上清液并裝入裝有核 - 殼珠的柱子中。
      

      然后通過肝素親和層析在第二步中進(jìn)一步純化從柱中收集的流體級分。然后在肝素親和過程后收集第二組流體級分并分析總蛋白和雙鏈DNA(dsDNA)含量。
      

      用于分離，定量和分析蛋白質(zhì)含量的分析技術(shù)包括Bradford測定，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，Western印跡分析和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。
      

      通過使用納米顆粒跟蹤分析(NTA)和透射電子顯微鏡(TEM)成像進(jìn)行進(jìn)一步的顆粒表征和尺寸分布分析。
      

      結(jié)果
      

      在收集的液體部分中發(fā)現(xiàn)EV的濃度顯著更高，而在洗脫峰中發(fā)現(xiàn)了VLP。不僅新技術(shù)能夠準(zhǔn)確地分離兩種分子，還觀察到VLP和EV在整個色譜過程中保持完整的球形。
      

      展望
      

      使用這種技術(shù)，研究人員能夠證明兩步法可以將VLP和EV分開，從而可以單獨研究它們。他們希望這種快速和可擴展的技術(shù)可以應(yīng)用于未來大規(guī)模生產(chǎn)VLP和EV，以更深入地了解這些分子的生物學(xué)功能。
      

      致謝
      

      本研究所做的工作得到了聯(lián)邦數(shù)字和經(jīng)濟(jì)事務(wù)部，聯(lián)邦運輸，創(chuàng)新和技術(shù)部，施蒂里亞商業(yè)促進(jìn)局SFG，Standortagentur Tirol，下奧地利州政府和ZIT - 技術(shù)機構(gòu)的支持。維也納市通過COMET資助計劃，由奧地利研究促進(jìn)局FFG管理。
      
			

			
        
      
			
      
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