國家人類基因組研究所(NHGRI)的研究人員開展的一項(xiàng)新研究正在挑戰(zhàn)驗(yàn)證DNA測序結(jié)果的傳統(tǒng)做法。該研究表明，更新，更快，“下一代”DNA測序(NGS)方法與Sanger測序一樣準(zhǔn)確 - 也許更準(zhǔn)確 - 這是一種經(jīng)過時(shí)間檢驗(yàn)的技術(shù)，通常用于確認(rèn)NGS結(jié)果。該研究可能對(duì)臨床樣本的DNA測序具有重要意義，并可能影響基因測試的診斷管道。

NHGRI醫(yī)學(xué)基因組學(xué)和代謝遺傳學(xué)分會(huì)主任，醫(yī)學(xué)博士Leslie Biesecker及其同事在2016年3月28日的“ 臨床化學(xué) ”雜志網(wǎng)絡(luò)版上報(bào)告了他們的發(fā)現(xiàn)。

Sanger測序方法在20世紀(jì)70年代后期爆發(fā)到遺傳學(xué)領(lǐng)域，研究人員將其視為DNA測序的金標(biāo)準(zhǔn)。由Frederick Sanger于1977年在英國開發(fā)的Sanger測序最終允許科學(xué)家區(qū)分構(gòu)成DNA分子的化學(xué)堿基的順序，使他們能夠理解細(xì)胞內(nèi)的指令，以構(gòu)建細(xì)胞需要進(jìn)行的蛋白質(zhì)和其他分子。它的任務(wù)。

在21世紀(jì)初期，NGS開始取代Sanger測序，因?yàn)樗軌蛲瑫r(shí)測序數(shù)百萬個(gè)DNA - 相比之下，與Sanger一次只有384個(gè) - 使NGS更快，更便宜。目前在一些臨床基因組測序?qū)嶒?yàn)室中的標(biāo)準(zhǔn)“最佳實(shí)踐”要求用Sanger確認(rèn)陽性NGS結(jié)果，這意味著更長的處理時(shí)間和更高的成本。

但有些人質(zhì)疑這種做法。“許多實(shí)驗(yàn)室和機(jī)構(gòu)將Sanger測序視為DNA測序的標(biāo)準(zhǔn)，”Biesecker博士說，“盡管缺乏數(shù)據(jù)表明它比新方法更準(zhǔn)確。”

此外，近年來的一些研究表明，NGS可以像Sanger測序一樣準(zhǔn)確地識(shí)別DNA序列中的差異 - 稱為基因組變體。

為了比較兩種方法，Biesecker博士的研究小組用從ClinSeq病人的DNA樣本®，一個(gè)NHGRI測序項(xiàng)目，旨在考察的大多是1500種健康人的基因組化妝。Biesecker博士，誰是ClinSeq主要研究者®，注意到一個(gè)事實(shí)，即許多參與者的DNA樣本已被雙方NGS和Sanger測序，因此提供的一組研究的理想樣本分析的優(yōu)勢。

“這些數(shù)據(jù)比其他任何研究小組都要大很多倍，”Biesecker博士說。“我們能夠檢測數(shù)百萬個(gè)通過NGS和Sanger測序進(jìn)行測序的DNA堿基對(duì)。”

“這些數(shù)據(jù)比其他任何研究小組都要大很多倍，”Biesecker博士說。“我們能夠檢測數(shù)百萬個(gè)通過NGS和Sanger測序進(jìn)行測序的DNA堿基對(duì)。”

研究人員使用ClinSeq ®樣品檢查從19個(gè)基因在基因測試通常審查五個(gè)參與者和他們相比，從同一樣品的Sanger測序結(jié)果NGS數(shù)據(jù)。兩種方法都確定了相同的234種變體。Biesecker博士說，結(jié)果表明Sanger驗(yàn)證沒有用，“因?yàn)閮煞N技術(shù)之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。” 然而，他指出，234種變體并不構(gòu)成一個(gè)大樣本量，可以從中得出結(jié)論。

他們接下來研究了一個(gè)更大的組，將來自684名參與者的5個(gè)基因中的NGS變體與Sanger測序鑒定的相同基因中的變體進(jìn)行比較。在NGS鑒定的5,660種變體中，19種未通過Sanger測序確認(rèn)的首次嘗試進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)研究人員對(duì)樣品進(jìn)行第二次Sanger測序時(shí)，19種中只有兩種仍然未經(jīng)證實(shí)。

“這項(xiàng)工作有兩個(gè)重要的結(jié)論，”比塞克博士說。“首先，調(diào)查結(jié)果只能通過使用Sanger確認(rèn)方法顯示5,660種變體中的兩個(gè)錯(cuò)誤，這是99.965%的確認(rèn)率。第二個(gè)結(jié)論是，對(duì)于19個(gè)分歧中的17個(gè)，Sanger是錯(cuò)誤的，而不是NGS。

“我們已經(jīng)證明，使用Sanger測序確認(rèn)單個(gè)DNA堿基替換是沒有意義的，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致更多的診斷錯(cuò)誤，而不是糾正，”Biesecker博士說。他解釋說，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)根據(jù)最初的Sanger結(jié)果做出決定，這意味著在Sanger測試中不正確的17個(gè)變種將被丟棄。

Biesecker博士說結(jié)果令人驚訝。“我們根本沒想到會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，”他說。“我們期望Sanger測序可以糾正錯(cuò)誤的NGS。相反，這意味著當(dāng)臨床實(shí)驗(yàn)室使用Sanger測序來驗(yàn)證結(jié)果時(shí)，更有可能丟棄實(shí)際上來自NGS的結(jié)果，而不是找到結(jié)果。 NGS錯(cuò)誤。“

根據(jù)Biesecker博士的說法，這些發(fā)現(xiàn)使人們懷疑是否應(yīng)該常規(guī)使用Sanger測序來確認(rèn)變異的NGS結(jié)果。然而，由于一些基因組測序測試結(jié)果可能對(duì)患者和家屬產(chǎn)生重要的醫(yī)學(xué)影響，他和他的合作者建議，訂購測試的醫(yī)生應(yīng)該決定何時(shí)Sanger測序或其他測試可能對(duì)確認(rèn)結(jié)果有用，而不是是常規(guī)的。

Biesecker博士指出，這些數(shù)據(jù)表明，NGS基因檢測確定的變異是準(zhǔn)確可靠的，但與所有其他醫(yī)學(xué)檢測一樣，基因檢測并不完美。他建議臨床醫(yī)生在考慮基因檢測結(jié)果以及是否需要進(jìn)行后續(xù)檢查或患者檢查時(shí)使用他們的訓(xùn)練和判斷。

NHGRI政策，傳播和教育部主任Laura Lyman Rodriguez博士建議，目前使用Sanger測序作為驗(yàn)證NGS變異結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)方法，該研究的結(jié)果可能會(huì)促進(jìn)及時(shí)的討論。

“隨著技術(shù)的成熟，驗(yàn)證下一代測序結(jié)果的最佳方法變得越來越重要，”Rodriguez博士說。“這些結(jié)果為科學(xué)界，醫(yī)學(xué)界和政策界提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，共同探討這項(xiàng)研究對(duì)制定該領(lǐng)域?qū)嵺`標(biāo)準(zhǔn)的意義。”